马欢欢，张 超，郑淑文，朱昭琼，刘 进

(1.遵义医学院 麻醉学系，贵州 遵义 563099；2.四川大学华西医院 麻醉科，四川 成都 610041)

基础医学研究

新生期大鼠重复吸入七氟烷对其成年期Aβ、Tau蛋白的影响

马欢欢1，张 超1，郑淑文1，朱昭琼1，刘 进2

(1.遵义医学院 麻醉学系，贵州 遵义 563099；2.四川大学华西医院 麻醉科，四川 成都 610041)

目的 研究新生期大鼠间断、重复吸入七氟烷,对其成年期行为学及β淀粉样蛋白(Aβ)、异常磷酸化Tau蛋白(PHF-Tau)在海马CA1区的表达。方法 7日龄SD大鼠24只，随机分为3组(n=8)，1.5%七氟烷组(S1组)，2.6%七氟烷组(S2组),对照组(C组)。分别于出生7、14、21 d(P7、P14、P21)吸入1.5%、2.6%七氟烷及运载气体1 h，于P91～P95行定位航行和空间探索实验。水迷宫实验结束后，取海马组织，用免疫组织化学的方法测定CA1区Aβ、PHF-Tau蛋白的表达。结果 ①与C组相比，P94，S1组、S2组逃避潜伏期延长(P<0.01或P<0.05)，P95，S1组潜伏期延长(P<0.05)；②与P91相比，C组、S2组P94和P95逃避潜伏期缩短(P<0.05)；S1组，P93逃避潜伏期缩短(P<0.05)；③与C组比较，S1组原平台象限滞留时间百分比减少(P<0.01)；④与C组比较，S1组PHF-Tau蛋白MOD增加(P<0.05),S1组、S2组Aβ蛋白MOD增加(P<0.05或P<0.01)。结论 新生期大鼠间断、重复吸入1.5%、2.6%的七氟烷可使其成年期学习记忆能力下降，其中吸入1.5%七氟烷较2.6%七氟烷影响更持久。其机制可能与成年期海马CA1区Aβ、PHF-Tau蛋白水平的改变有关。

七氟烷；学习记忆；Aβ蛋白；磷酸化Tau蛋白

临床研究显示：4岁以下的儿童接受手术麻醉后，可能影响孩子后期阅读能力的发展、书面语言的学习以及数学计算的能力[1-3]。七氟烷以诱导、复苏快及对气道刺激性小等优点广泛应用于小儿麻醉，而接受七氟烷麻醉后对成年期学习记忆是否改变及其机制尚未明了。因此，本实验通过对新生期大鼠间断、重复吸入七氟烷，于成年期测试其行为学及大鼠海马β淀粉样蛋白(Aβ)、异常磷酸化Tau蛋白(PHF-Tau)水平的表达，以期对婴幼儿期间断、重复接受手术(如烧伤、创伤、整形)是否对其成年期的学习记忆能力产生影响，提供基础实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物与分组 7日龄SPF级SD大鼠24只，雌雄不拘，由重庆第三军医大学实验动物中心提供。[sexk(渝)2007-0005]。随机分为3组(n=8)，1.5%七氟烷组(S1组)，2.6%七氟烷组(S2组),对照组(C组)。环境温度21±2 ℃，湿度55%～65%，12 h光照与黑暗交替。哺乳期母乳喂养。

1.2 药品、试剂与仪器 七氟烷(批号：65120301，鲁南贝特制药有限公司), Anti-beta antibody(批号：ab14220,abcam 公司，英国),Anti-Tau antibody(批号：ab3205,abcam 公司，英国)，GTVIsionⅢ鼠/兔通用二抗检测系统，Morris 水迷宫测试仪(成都泰盟科技有限公司)，气体监测仪(Dragra,德国)、自制吸入麻醉箱。

1.3 麻醉方法 将SD大鼠置于自制的循环密闭麻醉剂箱(78 cm×48 cm×15 cm)中,连接麻醉机，箱底铺一层(约2 cm)钠石灰，覆盖薄层纱布，每个实验日早上9∶00开始，按S1、S2及C组分别于P7、P14、P21吸入 1.5%七氟烷、2.6%七氟烷、运载气体(1 L O2+ 1 L 空气/min)1 h，实验中持续监测进气孔、出气孔的七氟烷浓度以控制实验条件。吸入结束待大鼠完全苏醒后放回原笼饲养。

1.4 行为学认知功能测试

1.4.1 定位航行 待3次吸入麻醉结束后，于P91～P95d行定位航行实验。采用Moriss水迷宫进行测试，观察并记录大鼠寻找并爬上平台所需的时间(即逃避潜伏期)。

1.4.2 空间探索 于定位航行实验结束后，撤去平台，行空间探索试验，记录小鼠穿越平台象限滞留时间百分比和进入次数百分比。

1.5 免疫组织化学方法测定海马CA1区Aβ、异常磷酸化Tau蛋白的表达 于Morris水迷宫试验结束当日，按C组、S1组、S2组分组以1%戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛经主动脉行脑灌注，取出海马组织行石蜡包埋、切片、二甲苯脱蜡、酒精梯度复水、微波抗原修复、BSA封闭(30 min)、加入Aβ、磷酸化Tau蛋白抗体(Aβ1∶400、Tau 1∶400)检测其表达。4 ℃孵育过夜、复温、生物素标记二抗、DAB显色(显微镜镜下控制反应)，苏木素复染，脱水、透明，中性树胶封片。PBS代替一抗作阴性对照。 400倍光镜下显微镜荧光图像分析系统(Leica公司，德国)分析海马在CA1区Aβ、PHF-Tau蛋白的表达，每张切片取CAl区，每区随机取4个视野，应用Image-Pro Plus分析系统观察192(2蛋白×24标本×4视野=192)个视野细胞阳性反应平均光密度(MOD)值进行测量分析[4]。

2 结果

2.1 行为学测试结果

2.1.1 组间比较 P94，与C组比较， S1组、S2组逃避潜伏期延长(P<0.01或P<0.05)；P95，与C组比较，S1组潜伏期延长(P<0.05)。

2.1.2 组内比较 C组中，与P91比较，P94、P95逃避潜伏期缩短(P<0.05),S1组中，与P91比较，P93逃避潜伏期缩短(P<0.05)；S2组中，与P91比较，P94、P95逃避潜伏期均缩短(P<0.05)(见表1)。

2.1.3 空间探索 与C组比较，S1组原平台象限滞留时间百分比明显减少(P<0.01)(见表2)。

组别第91天第92天第93天第94天第95天C组17．25±6．5015．72±7．1914．56±4．0710．98±2．22&10．92±2．64&S1组19．47±8．3615．57±7．5713．34±4．05&13．94±2．89∗14．55±2．83#S2组20．27±8．1220．07±7．4616．16±5．3515．55±2．69#&13．08±3．27&

与对照组比较，*P<0.01,#P<0.05, 与P91比较，&P<0.05。

组别原平台象限滞留时间(%)原平台象限进入次数(%)C组31．92±4．5326．00±5．98S1组21．50±7．17∗25．88±5．49S2组27．09±4．9221．75±5．75

与对照组比较，*P<0.01。

2.2 生化指标Aβ、PHF-Tau蛋白检测结果

2.2.1 Aβ蛋白与C组比较，S1组、S2组Aβ的MOD显著增加(P<0.05或P<0.01)。

2.2.2 异常磷酸化Tau蛋白 与C组比较，S1组PHF-Tau蛋白的MOD显著增加(P<0.05，见表3)。

组别AβPHF-TauC组0．334±0．1100．415±0．067S1组0．462±O．142∗0．460±O．099#S2组0．414±0．123#0．437±0．094

与C组比较，*P<0.01，#P<0.05。

3 讨论

研究表明，啮齿类动物的脑神经元在新生期的发育最为敏感，包括神经元再生、分化、迁移和细胞死亡都在这一时期快速形成，而这些大多与海马的学习和记忆有关。脑发育的高峰在产后第2 周(P7～P14)，P21后几乎没有出现神经元凋亡[5]。因伦理问题无法直接使用人类进行海马相关实验，根据大鼠与人类基因的同源性，本实验选取新生SD大鼠同时在P7、P14、P21天间断重复吸入七氟烷亚麻醉浓度0.75MAC[6](1.5%七氟烷)，临床麻醉浓度1.3MAC(2.6%七氟烷)，模拟临床在0～6月、1岁、3岁期间反复多次接受麻醉的患儿，观察对其在成年期的学习记忆影响情况。

CA1区被认为是海马记忆信号的主要输出区域，是学习、记忆，信息处理及信号传递的重要部位[7]。CA3区的锥体细胞将信息通过Schaffer侧支突触传给CA1区，CA1区的记忆细胞随位置编码的动态变化，可以促进在同样的环境下发生的不同事件具有不同记忆痕迹[8]，此区域β淀粉样蛋白聚集和Tau蛋白异常磷酸化可引起学习记忆能力的改变[9]，因此本实验选取海马CA1区并观察其上蛋白的变化。

Morris水迷宫为检测行为学的“金指标”，其中包括定位航行和空间探索，本实验结果显示：P94，S1组、S2组与C组比较有统计学意义，且S1组差异更显著(P<0.01)，表明大鼠在新生期间断、重复吸入七氟烷后，在其成年期第94天出现学习记忆能力下降；P95,与C组比较，S1组有统计学意义(P<0.05)，S2组无统计学意义，表明吸入1.5%七氟烷对学习记忆的影响更持久，而2.6%七氟烷对学习记忆的影响相对短暂。组内比较，C组，P94、P95与P91比较，逃避潜伏期缩短(P<0.05)，说明建模成功。S1组，P93与P91比较有统计学意义，S2组，P94与P91比较,有统计学意义，说明吸入七氟烷的大鼠仍然具有学习记忆能力，且吸入1.5%七氟烷较2.6%七氟烷的大鼠提前具备，且峰值在成年期第93天。空间探索实验结果同样显示，与C组比较，S1组原平台象限滞留时间百分比减少(P<0.01)，说明空间整合记忆受损[10]。

大量研究表明，吸入麻醉药可引起β淀粉样蛋白聚集和Tau蛋白过度磷酸化，其病理改变在大脑皮层和海马形成老年斑(SP)和大量的神经原纤维缠结(NFTs),并伴随大量神经丧失，从而导致学习和记忆功能障碍[11-12]。MOD是通过比较光密度来反映阳性细胞所表达的蛋白量大小,其原理是根据细胞内不同化学成分的染色反应具有不同的吸收波长，并且化学反应在吸收值和细胞化学含量间存在一定的化学剂量关系的特点，衡量组织或细胞中某种成分的含量，因此本实验选择MOD来测Aβ、异常磷酸化Tau蛋白其结果相对可靠[4]。

β淀粉样蛋白存在于正常大脑中，是一个产生、降解和清除的平衡过程。正常生理条件下，淀粉样前体蛋白(APP)经非Aβ生成途径代谢。病理状态下，APP的非Aβ源加工途径受抑制，Aβ途径被激活，导致Aβ的生成过多及Aβ的降解和清除受抑制，最终导致Aβ的积聚，成老年斑(SP)[13]。从实验结果可以看出，S1组、S2组Aβ的MOD高于C组，推测本实验观察到的大鼠在新生期间断、重复吸入七氟烷后，在其成年期学习和记忆能力下降可能与Aβ的积聚有关。

Tau蛋白为含磷酸基的微管相关蛋白，正常成熟脑中含2～3个磷酸基，在微管组装中起着重要的作用，有利于正常成熟神经元轴突的完整性和稳定性；过度异常磷酸化的Tau蛋白含5～9个磷酸基，其引起主要病理改变为：在神经元中重新分布组合成不溶性、不能与微管结合的双螺旋细丝(PHFs)，进而聚集成神经原纤维缠结(NFTs)。而NFTs长期以来被认为是神经退行性病变和进行性功能障碍的主要参与者[14]。本实验结果显示：与C组比较，S1组PHF-Tau的MOD显著升高(P<0.05)，而S2组无统计学意义，与行为学结果相一致，推测吸入1.5%七氟烷后在其成年期P95依然存在行为学能力下降，可能与此时仍然存在异常磷酸化的Tau蛋白有关。

综上所述，新生期大鼠间断、重复吸入1.5%、2.6%七氟烷可使其成年期学习记忆能力下降，其中吸入1.5%七氟烷较2.6%七氟烷影响更持久。其机制可能与海马CA1区β淀粉样蛋白的沉积和异常磷酸化的Tau蛋白水平的改变有关。

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[收稿2014-09-17;修回2014-10-20]

(编辑：王福军)

Effects of repeatedly-inhaled sevoflurane in the neonatal period on Tau and amyloid beta protein expressions in adulthood

MaHuanhuan1,ZhangChao1,ZhengShuwen1,ZhuZhaoqiong1，LiuJin2

(1.Department of Anesthesiology, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China;2.Deparment of Anesthesiology,West China Hospital of Sichuan University,Chengdu Sichuan 610041,China)

Objective To study the effects of interrupted and repeated inhalation of sevoflurane in neonatal rats on praxiology of adulthood and the expressions of amyloid beta-protein (Aβ) and abnormal phosphorylated Tau (PHF-Tau) protein in the CA1 area of hippocampus.Methods Twenty-four Seven-day old neonatal SD rats were divided into 3 groups randomly (n=8 in each group), 1.5% sevoflurane (group S1), 2.6% sevoflurane (group S2) and the control group ( group C). Rats in each group were inhalated 1.5%, 2.6% sevoflurane and carrier gas for 1 h in the 7th(P7),14th(P14), 21thday (P21), respectively. Rats were tested via a water maze experiment in P91-P95 and the escape latency and retention time in the original platform quadrant and the percentage of entering times in spatial probe test were recorded. The hippocampus afer morris water maze test was collected to determine the expressions of Aβ and PHF-Tau protein with immunohistochemical method.Results 1)Compared with group C, escape latencies in groupS1and group S2were prlonged (P<0.01 orP<0.05) in the 94th day and in group S1in the 95th day (P<0.05);2)The escape latency was decreased in P94 and P95 of group C and group S2 and P93 of group S1 compared with that in P91 (P<0.05);3)Compared with group C, the percentage of retention time in the original platform quadrant was significantly reduced in group S1 (P<0.01);4)Compared with group C, the mean opticaldensity (MOD) of PHF-Tau protein in group S1 (P<0.05) and Aβ in group S1 and S2 (P<0.01 orP<0.05) was increased.Conclusion The interrupted and repeated inhalation of 1.5% and 2.6% sevoflurane on neonatal rats could impair learning and memory in adulthood, in which the effects of inhalation of 1.5% sevoflurane lasted longer than those of 2.6% sevoflurane. The mechanisms might be related to the deposition of Aβ protein and changes of the PHF-Tau protein expression.

sevoflurane; learning and memory; Aβ; PHF-Tau

国家自然科学基金资助项目(NO:81360180)；山东鲁南制药集团资助项目(NO:遵鲁药[2010]001)。

朱昭琼，女，博士，主任医师，硕士生导师，研究方向：吸入麻醉，E-mail:13511805815@163.com。

R614.2

A

1000-2715(2015)01-0060-04