田 伟，顾 燕，邓胜利，张 琳

(遵义医学院 麻醉学系暨贵州麻醉与器官保护基础研究重点实验室，贵州 遵义 563099)

基础医学研究

UrocortinⅠ后处理对缺氧/复氧大鼠心肌线粒体膜电位的影响

田 伟，顾 燕，邓胜利，张 琳

(遵义医学院 麻醉学系暨贵州麻醉与器官保护基础研究重点实验室，贵州 遵义 563099)

目的 探讨UrocortinⅠ后处理对缺氧/复氧后成年大鼠心肌细胞线粒体膜电位的影响。方法 利用离体心脏灌注装置(MPA)分离成年大鼠心肌细胞，培养24 h后进行细胞计数并随机分为正常组(N组)、缺氧/复氧组(I/R组)、UrocortinⅠ后处理组(UcnⅠ组)、5-羟葵酸拮抗UrocortinⅠ组(5-HD+UcnⅠ组)。N组在预设37 ℃培养箱中持续培养135 min；余3组均予缺氧40 min，复氧60 min建立缺氧/复氧模型。其中UcnⅠ组在缺氧末复氧前给予UcnⅠ处理30 min；5-HD+UcnⅠ组在UcnⅠ处理前给予特异性线粒体ATP敏感性钾通道(mito-KATP)拮抗剂5-HD处理5 min，余处理同UcnⅠ组。各组于复氧末加入JC-1荧光探针并用激光共聚焦显微镜观察心肌细胞膜电位的变化。结果 N组心肌细胞高膜电位比例均高于其余各组(P<0.01)，而UcnⅠ组高膜电位比例高于I/R组和5-HD+UcnⅠ组(P<0.05)，I/R组与5-HD+Ucn I组比差异无统计学意义(P>0.05)。结论 UcnⅠ后处理可防止缺氧/复氧后心肌细胞线粒体膜电位的下降，保护复氧后心肌线粒体的膜电位。

UrocortinⅠ；后处理；缺氧/复氧；线粒体膜电位；心肌保护

相关研究表明线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential MMP)与心肌缺血再灌注损伤(MIRI)时的细胞凋亡有关，而线粒体ATP敏感性钾通道(mito-KATP)的开放可抑制膜电位下降[1]。UrocortinⅠ(UcnⅠ)是一种内源性神经肽，研究发现其后处理可通过抑制线粒体凋亡通路的活化产生心肌保护[2]。但该保护作用是否与MMP变化有关及与mito-KATP 之间存在怎样的关系尚不清楚。本实验拟通过建立缺氧/复氧再灌注损伤模型，观察UcnⅠ后处理对心肌细胞线粒体膜电位的影响，探讨其发挥心肌保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 SPF级成年健康雄性Sprague Dawley大鼠24只，体重250～300g(第三军医大学大坪医院实验动物中心，许可证号：SCXK(渝)2012-0005)；M199型培养基，层黏连蛋白，EGTA，Ⅱ型胶原酶，BSA，UrocortinⅠ，5-羟葵酸(美国，sigma公司)；国产分析纯；JC-1线粒体膜电位检测试剂盒(江苏碧云天生物研究所)；MPA离体心脏灌注装置系列(北京吉安德尔科技有限公司)；SP2型激光共聚焦显微镜(德国，莱卡公司)；倒置相差显微镜(日本，OLYMPUS CK2公司)；二氧化碳培养箱(美国，Forma公司)；超纯水处理机(美国，Millipore)。

1.2 实验分组与处理 成年SD大鼠心肌细胞分离与培养参考文献[3]，培养24h后的心肌细胞随机分为4组：正常组(N组)、缺氧/复氧组(I/R组)、UrocortinⅠ后处理组(UcnⅠ组)、5-羟葵酸拮抗UrocortinⅠ组(5-HD+UcnⅠ组)。其中N组在预设37 ℃95%O2+5% CO2培养箱中持续培养135 min；I/R组正常培养35 min后放入37 ℃95%N2+5% CO2培养箱缺氧40 min，再复氧60 min；UcnⅠ组缺氧40 min复氧5 min后在培养基中加入浓度为10-8mol/L UcnⅠ10 μL培养30 min，复氧60 min；5-羟葵酸拮抗UrocortinⅠ组(5-HD+UcnⅠ组)缺氧40 min后于培养基中加入浓度为0.1 mmol/L5-HD10 μL培养5 min，余处理同UcnⅠ组。各组于复氧末加入JC-1荧光染色工作液并行激光共聚焦显微镜测定线粒体膜电位变化。

1.3 激光共聚焦显微镜测定线粒体膜电位 上述各组复氧末心肌细胞按JC-1膜电位检测试剂盒说明进行操作：室温避光条件下，吸除细胞培养基，另加入1 mL细胞培养基及1 mLJC-1染色工作液，放置37℃细胞培养箱中孵育20min。孵育期间，用去离子水将JC-1(5×)染色缓冲液按照4∶1比例稀释，并放置37 ℃水浴箱中预热。孵育结束后，吸除上清液，用JC-1(1×)染色缓冲液洗涤4次，加入2 mL细胞培养基。在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质中形成JC-1聚合物产生红色荧光；在线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体基质中，此时JC-1为单体形式产生绿色荧光。激光共聚焦显微镜单盲(实验者不盲、图像及数据采集者盲)法随机各组采集8个不同视野内的30个心肌细胞分别测定红、绿荧光强度并计算其红/绿荧光比值，以判断线粒体高膜电位比例的变化。

2 结果

激光共聚焦显微镜下各组心肌细胞膜电位荧光图(见图1)。其荧光比值结果显示N组心肌细胞高膜电位比例均高于其余各组(P<0.01)，而UcnⅠ组高膜电位比例高于I/R组和5-HD+UcnⅠ组(P<0.05)，I/R组与5-HD+Ucn I组比较差异无统计学意义(P>0.05，见表1)。

A：N组；B：I/R组；C：UcnⅠ组；D：5-HD+UcnⅠ组。

组别红/绿荧光比例Nor组1．57±0．14I/R组0．67±0．03aUcnⅠ组1．31±0．04ab5-HD+UcnⅠ组0．69±0．04ac

a:与 Nor组比较，P﹤0.01；b:与I/R组比较，P﹤0.05；c:与UcnⅠ组比较，P﹤0.05。

3 讨论

1986年Murry[4]首次提出缺血预处理(ischemic preconditioning,IP)：预先反复、短暂进行心肌缺血再灌注，可减轻后续心肌较长时间缺血所致的心肌损伤并增强其耐受性。然而预处理需在缺血前实施，而临床工作中缺血时间具有不可预测性，故限制了其在临床上的应用。继而Zhao等[5]于2003年提出了缺血后处理(ischemic postconditioning，IPO)概念：即在心肌缺血后再灌前给予数次短暂重复缺血/再灌注，有与缺血预处理相似的心肌保护作用。然而IPO需阻断血流，存在反复嵌闭血管并增加手术操作步骤所带来的风险。因此为了提高其安全性及可控性，有学者提出药物后处理将可能成为很好的替代方式。药物后处理为心肌缺血后再灌前使用的作用于特异靶点的药物，能产生与IPO相同的抗MIRI作用且减少IPO过程中反复操作带来的血管机械性损伤，因此备受关注。

线粒体是细胞能量生成与储存的场所。其内膜上的质子泵通过跨膜转运使线粒体内膜间隙带大量正电荷，而膜内基质带大量负电荷，使线粒体膜内外形成质子梯度的电位差即线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential MMP)。其线粒体内膜上的ATP合成酶可利用此跨膜电势能合成细胞发挥正常功能所需的ATP。故线粒体MMP的正常与否将影响细胞乃至整个机体的正常生理功能。

既往研究已证实：细胞凋亡(apoptosis)可能是导致MIRI的重要原因[6]，它是一种有序的或程序性的细胞主动死亡方式。而在导致细胞凋亡的三条基本途径中，线粒体介导的内源性途径被认为是MIRI后细胞凋亡的主要途径[7]。且发现在各种不同作用因子诱导的不同类型的细胞凋亡过程中，均出现了MMP下降，其MMP下降还往往早于细胞形态学的改变。UcnⅠ预处理可通过自分泌或旁分泌方式激活多种蛋白激酶或保护MMP、抑制细胞凋亡等方式发挥抗MIRI作用[8-9]。近来研究发现，UcnⅠ后处理也具有抗MIRI的作用[10]，但其后处理的心肌保护作用与MMP之间的关系不是十分明了。

本研究利用激光共聚焦显微镜检测技术发现：N组线粒体MMP高于其余各组，说明 MMP下降是MIRI后的重要表现之一，与以往研究结果一致[11]。而UcnⅠ后处理其线粒体MMP高于I/R组和5-HD+UcnⅠ组，表明UcnⅠ后处理可稳定缺氧复氧后心肌细胞线粒体的膜电位。为了证实UcnⅠ稳定MMP的作用是否与mito-KATP通道的开放有关，本研究选择了mito-KATP特异性阻断剂5-HD。从表1结果中可看出5-HD+UcnⅠ组MMP较N组及UcnⅠ组低，与I/R组无差异。提示5-HD阻断了UcnⅠ后处理对MMP的稳定作用，证明UcnⅠ后处理稳定MMP的作用是通过开放mito-KATP实现。其机制可能是UcnⅠ后处理通过开放mito-KATP通道，增加K+外流，抑制电压依赖性钙通道的Ca2+内流，致细胞膜超极化，超级化阻止细胞对钙的重摄取，加速钠钙交换，减轻线粒体钙超载，恢复线粒体内膜质子泵功能，阻止线粒体通透性转换孔(MPTP)过度开放，从而稳定线粒体膜电位。而MMP的稳定又可防止细胞凋亡进而发挥心肌保护作用[12]。

综上所述，UcnⅠ后处理可稳定缺氧/复氧后心肌细胞线粒体膜电位，其机制可能与mito-KA0TP

开放有关。但UcnⅠ后处理发挥的心肌保护效应与MMP之间的直接证据尚待证明。

[1] Li J, Lang M J,Mao X B,et al.Antiapoptosis and mitochondrial effect of pioglita-zone preconditioning in the ischemic/reperfused heart of rat[J].Cardiovasc Drugs Ther,2008,22(4):283-291.

[2] 欧袁,杨双强,辛东.Urocortin后处理抑制线粒体凋亡通路保护心肌缺血再灌注损伤[J].重庆医科大学学报,2010,35(8):1187-1190.

[3] 张琳,邓胜利,姚刚,等. UrocortinⅠ对缺氧/复氧心肌细胞钙离子的影响[J].遵义医学院学报,2012,35(3):193-195.

[4] Murry C E, Jennings R B, Reimer K A. Preconditioning with isichemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium[J].Circulation,1986,74(5):1124-1136.

[5] Zhao Z Q, Corvera J S, Halkos M E, et al. Inhabition of myocardial injury by ischemic postconditioning during reperfusion:comparision with preconditioning[J].AM J Physiol Heart Circ Physiol,2003,285(2):579-588.

[6] Eefting F,Rensing B,Wigman J,et al.Role of apoptosis in reperfusion injury [J].Cardiovascular Research,2004,61(3):414-426.

[7] Gomez L,Chavanis N,Arqaud L,et al.Fas-independent mitochondrial damage triggers cardio myocyte death after ischemia-reperfusion[J].Am J Physiol Heart Circ Phvsiol,2005,289(5):2153-2158.

[8] Cong B,Wang L,Zhu X,et al.SGK1 Is Involved in Cardioprotection of Urocortin-I Against Hypoxia/Reoxygenation in Cardiomyocytes[J]. Can J Cardiol,2014,30(6):687-695.

[9] 顾燕,孙文婷,邓胜利,等.UrocortinⅠ预处理对缺氧/复氧大鼠心肌线粒体膜电位的影响[J].遵义医学院学报,2013,36(4):336-338.

[10] 尹雪莲, 成蓓. Urocortin调控Bcl-2家族与大鼠/复氧心肌细胞凋亡[J].循环学杂志,2005,15(4):22-24.

[11] Sharikabad M N,Ostbye K M,Brors O,et al.Increased Mg2+reduces Ca2+influx and disruption of mitochondrial membrane potential during reoxygenation[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2001,281(5):2113-2123.

[12] Eirin A,Li Z,Zhang X,et al. A mitochondrial permeability transition pore inhibitor Improves renal outcomes after revascularization in experimental atherosclerotic renal artery stenosis[J].Hypertension,2012,60(5):1242-1249.

[收稿2014-11-04;修回2014-12-08]

(编辑：王福军)

Effects of Urocortin I postconditioning on mitochondrial membrane potential during myocardial hypoxia/reoxygenation injury

TianWei,GuYan,DengShengli,ZhangLin

(Department of Anesthesiology,Zunyi Medical University,Guizhou Key Laboratory of Anesthesia and Organ Protection,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To investigate the effects of mitochondrial membrane potential changes in Urocortin I-postconditioning of myocardial hypoxia/reoxygenation injury.Methods Myocardial cells of adult rats were isolated using the MPA isolated heart-perfusion system. Myocardial cells were divided into four groups after 24 h cultures : normal group (N), hypoxia/reoxygenation group (I/R), Urocortin I group (Ucn I), and 5-hydroxydecanoate + Urocortin I group(5-HD+Ucn I). The cells of group N was cultured continuously in the 37 ℃ incubator for 135 minutes while other groups experienced anoxia for 40 minutes and reoxygenation for 60 minutes to produce hypoxia/reoxygenation model. Ucn I group and group 5-HD were given Ucn I-postconditioning for 30 minutes after hypoxia. 5-HD was added to group 5-HD + Ucn I for 5 minutes before adding Ucn I.at the end of reoxygenation process.The cultured cardiomyocytes were mixd with JC-1 to detect the changes of mitochondrial membrane potential by laser scanning confocal microscope.Results Normal group had the highest mitochondrial membrane potential(P<0.05)while the potential of Ucn I group is higher than that that in I/R group and 5-HD+ Ucn I group(P<0.05).There was no significant difference between group I/R and group 5-HD+Ucn I(P>0.05).Conclusion Ucn I-postconditioning could prevent the mitochondrial membrane potential reduction after myocardial cells suffer from hypoxia/reoxygenation and the mechanism may be mediated through the opening of mito-KATPchannel.

UrocortinⅠ; postconditioning; Hypoxia/reoxygenation; mitochondrial membrane potential;myocardial protection

贵州省科学技术基金资助项目(NO：黔科合SY字[2013]3024)。

邓胜利，男，教授，硕士生导师，研究方向：心肌保护，E-mail:zydsl2004@163.com。

R614

A

1000-2715(2015)01-0064-03