张红燕，郑代军，李长福，杨加伟，陈永正

(1.遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院基础医学院 生物化学教研室，贵州 遵义 563099)

基础医学研究

单加氧酶基因筛选表达及其在苯甲亚砜中的合成应用

张红燕1,2，郑代军1，李长福2，杨加伟2，陈永正1

(1.遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院基础医学院 生物化学教研室，贵州 遵义 563099)

目的 克隆和表达假单胞菌菌株PseudomonasmonteiliiCCTCC M2013683的单加氧酶基因并研究其在手性亚砜合成中的应用。方法 根据假单胞菌菌株PseudomonasmonteiliiCCTCC M2013683基因组序列，选取3个单加氧酶基因设计特异性的PCR引物，利用PCR技术，以菌株基因组DNA为模板扩增基因片段，构建重组质粒pET-32a-pmmo，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导表达目的蛋白。以构建的重组菌为生物催化剂，苯甲硫醚为底物进行催化反应。结果 扩增获得了3个目的基因并构建了相应的重组质粒，诱导表达的3个重组蛋白中有2个(pmmo-3546、pmmo-6814)具有活性，可催化苯甲硫醚转化为R构型的苯甲亚砜。结论 成功获得了具有R-选择性催化苯甲硫醚活性的单加氧酶重组蛋白。

单加氧酶; 苯甲硫醚；生物催化；手性亚砜

手性亚砜是重要的手性辅剂、手性配体和手性药物中间体[1-3]。例如，手性亚砜可用于重要手性胺类和手性氨基酸及多种天然产物的合成[4-7]。另外，胃溃疡、十二指肠溃疡以及反流性食管炎的治疗均需用到质子泵抑制剂奥美拉唑、兰索拉唑、雷贝拉唑等，而该类质子泵抑制剂均含有亚砜活性基团[8]。所以对潜手性的硫醚的不对称催化以取得高光学纯度的亚砜具有重要意义。单加氧酶是有机氧化反应中是起关键作用的生物催化剂，通常具有较高的对映或区域选择性[9-11]。

课题组在前期研究中从西南地区土壤中成功筛选出了高活性、高选择性和高底物耐受性的硫醚单加氧酶产生菌株假单胞菌PseudomonasmonteiliiCCTCC M2013683，以该菌株作为催化剂氧化芳香硫醚类底物，在底物浓度30 mM情况下，获得了大于99%产率和99%对映选择性的手性苯甲亚砜[12]。在此基础上，我们对该菌株进行全基因组测序分析，从测序结果中筛选单加氧酶基因，并构建基因工程菌，以整细胞作为生物催化剂，研究催化苯甲硫醚合成苯甲亚砜的不对称氧化反应，为后续的深入研究建立基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂PseudomonasmonteiliiCCTCC M2013683由本实验室保存。表达质粒pET-32a购于长沙赢润生物技术有限公司；pGEM-T Easy Vector 购于普洛麦格生物技术有限公司；基因组DNA Ligation Kit Ver.2.1、Taq DNA Polymerase、DNA连接试剂盒、购于TaKaRa Biotech公司；限制性内切酶BamHⅠ和 Hind Ⅲ购于thermo science； IPTG 、氨苄青霉素购于北京索莱宝公司；DNA Marker、质粒提取试剂盒、宿主菌E.coliBL21(DE3) 、E.coliDH5α购于北京博迈德基因技术有限公司 AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒购于康宁生命科学有限公司；苯甲硫醚购于百灵威 ；其余试剂为国产分析纯。扩增目的基因引物如表1所列。引物序列中下划线部分分别为限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ的酶切位点，引物由北京博迈德生物公司合成。

表1 引物序列

基因名称引物序列pmmo3538hsaBFACCGGGATCCATGATCGAACCAGGCATCpmmo3538hsaBRCCTTAAGCTTACCCAAGGGGGGCApmmo3546hsaBFCTGCGGATCCATGATCGACGCAACCGTCTpmmo3546hsaBRAACCAAGCTTGGCAAAGGCCGGCAGpmmo6814ntaBFACTCGGATCCATGCAGACCGTTGAACACGAATpmmo6814ntaBRACCGAAGCTTGTAGGCTTTGTCCCAGCT

1.2 蒙氏假单胞菌基因组DNA的提取 按照TaKaRa 试剂盒提供的方法操作，主要步骤如下：1.5 mL Tube收集细菌，10 000 g离心2 min，弃上清，加入180 μL的Buffer GL、20 μL的Proteinase K和10 μL的RNase A(10 mg/mL)，充分吸打混匀，置于56 ℃水浴中温浴10 min。 接着加入200 μL的Buffer GB和200 μL100%乙醇，充分吸打混匀。溶液移至Spin Column中，10000 g离心2 min，弃滤液。加入洗脱液清洗2次，弃滤液，在Spin Column膜的中央处加入50 μL Elution Buffer，室温静置5 min。10000 g离心2 min洗脱DNA，-20 ℃保存。

1.3 pmmo的扩增 以提取的基因组DNA为模板，使用表1中的引物扩增。PCR反应体系如下：2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL 、基因组DNA 1 μL、上下游引物各0.5 μL、ddH2O 10.5 μL。PCR反应条件：95 ℃ 10 min； 98 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s循环；72 ℃延伸10 min，30个循环。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳验证是否获得符合目的基因大小的片段。

1.4 表达载体的构建 按照AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒操作方法回收PCR产物。回收的PCR产物通过T-A克隆方法连接于pGEM-T Easy载体，连接产物热激法转化于E.coliDH5α感受态细胞，经菌液PCR鉴定后，抽取阳性克隆的质粒进一步双酶切验证，阳性克隆送至北京博迈德公司测序，验证序列是否正确。测序验证序列正确的阳性重组质粒用限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ进行双酶切，载体pET32a(+)对应双酶切，酶切回收的目的片段和载体16 ℃连接4 h，连接产物转化于E.coliDH5α感受态细胞中，培养长出的单克隆菌落经菌液PCR验证后，抽提质粒双酶切，阳性重组质粒pET32a-pmmo和空载体pET32(a+)分别转化于E.coliBL21(DE3)中，涂布于含氨苄青霉素终浓度为100 μg/mL的抗性平板，37 ℃恒温倒置培养12～16 h。单菌落经验证后的阳性重组子甘油(终浓度为20%)保存于-80 ℃冰箱。

1.5 重组蛋白表达 保存于甘油中的重组菌pET32a-pmmo/BL21(DE3)和空质粒对照菌pET32a/BL21(DE3)菌经划线复活后，用灭菌10μL吸头挑单菌落于3 mL含相应抗生素的液体LB培养基中，37 ℃振荡培养12 h，取1%接种量转接于新鲜的含抗生素的50 mL LB液体培养基中，37 ℃ 250 rpm振荡培养OD600为0.6 (约3h)，加入IPTG(终浓度)为0.5 mM，25 ℃ 160 rpm诱导培养8h。诱导结束后4 500 g离心5 min收集菌体，菌体重悬于PBS(50 mM，pH=7.0)中，菌浓度为50g/L。利用细胞破碎仪破碎菌体(9 Mpa)，15 000 g离心5 min去细胞碎片，取上清与5x上样缓冲液混合后，于恒温金属浴中100 ℃加热8 min后作SDS-PAGE电泳分析。

1.6 重组菌生物转化反应及检测 5 mL的反应体系中加入2 mM的苯甲硫醚和0.25 g湿菌体，30 ℃，250 rpm振荡反应24 h，反应结束后加入5mL乙酸乙酯振荡终止反应，萃取反应的底物和产物，离心取上层有机相用无水硫酸钠干燥，取上清300 μL于样品瓶中，并加入同等体积的异丙醇，经HPLC分析，依据峰面积计算产物产率和光学纯度。使用高效液相色谱仪对苯甲亚砜进行手性分析，流动相正己烷/异丙醇(93:7，v/v)，流速为0.7 mL/min，检测器波长为254 nm，使用OD-H柱(Daicel, 4.0 mm Ф×10 mmL)，(R)-苯甲亚砜的出峰时间为16.6 min，(S) -苯甲亚砜的出峰时间为23.0 min。

2 结果

2.1 基因组DNA的提取与单加氧酶扩增产物 利用DNA提取试剂盒顺利获得了PseudomonasmonteiliiCCTCC M2013683菌株基因组DNA，1 %琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1A所示：条带整齐均一且无RNA残留，可用于后续实验。以蒙氏假单胞菌基因组DNA为模板，利用所设计的特异性引物进行PCR扩增，获得了大小约为500 bp的pmmo-3538和pmmo-3546基因，以及大小约为1 000 bp的pmmo-6814基因，PCR产物电泳结果如图1B所示。最后将3个单加氧酶基因克隆至pGEM-T Easy载体并测序以确保序列正确。

A：基因组DNA电泳图，1：marker；2：基因组DNA；B：3个单加氧酶的PCR产物电泳图，1：marker ；2：pmmo-3538；3：pmmo-3546；4：pmmo-6814，条带大小分别为483bp，483bp，969bp。

2.2 目的基因的序列测定和表达载体的构建 双酶切3个目的基因与表达载体pET32a(+)后进行体外连接并转化至大肠杆菌DH5α，每个基因挑选3个转化后的单克隆进行菌液PCR鉴定。图2A中的结果显示：所有样品均通过菌液PCR扩增到了符合预期大小的基因片段，表明挑选的3个基因的单菌落均为阳性克隆。接着，本研究抽提以上阳性重组子的质粒进一步进行酶切鉴定，结果显示(见图2B)所有重组质粒均通过酶切获得了与预期大小相符的目的片段条件。以上数据表明重组表达载体构建成功，阳性重组质粒接下来转入表达菌株BL21(DE3)中来进行后续的蛋白表达研究。

A：重组表达质粒pET32a-pmmo菌液PCR鉴定结果，1：marker；2～4：pmmo-3538 不同单克隆；5～7：pmmo-3546 不同单克隆 ；8～10：pmmo-6814 不同单克隆；箭头所指为目标条带，下同；B：重组表达质粒pET32a-pmmo BamHⅠ和HindⅢ双酶切结果，1：marker；2～4：pmmo-3538 不同单克隆；5～7：pmmo-3546 不同单克隆 ；8～10：pmmo-6814 不同单克隆。

2.3 目的蛋白的诱导表达 将未诱导和诱导后的重组菌与空质粒菌离心收集后高压破碎，离心去细胞碎片等不溶物，取上清作SDS-PAGE分析，结果如图3所示：与诱导前相比，诱导后的3个重组菌均表达出了大量的重组蛋白，大小分别为17、17、35 KD。由于重组蛋白带有载体上的标签，所以其大小均比相应的内源表达蛋白大20 kD，重组蛋白大小与预期相符。结果说明重组蛋白诱导表达成功。

2.4 重组菌生物转化反应 收集将诱导表达后的3个重组菌和1个含空质粒的对照菌，以重组菌作为催化剂催化苯甲硫醚，HPLC检测苯甲亚砜的生成情况。表2中的结果显示：以含空质粒的对照菌pET32a/BL21(DE3)催化剂基本无苯甲亚砜的生成，且无选择性(转化率仅为2.2%)。与对照菌相比，以含有重组质粒pET32a-pmmo-3546和pET32a-pmmo-6814的重组菌为催化剂，检测到了明显的苯甲亚砜产物，转化率分别为2.9% 和8.5%，且产物均为R构型。以上数据说明本研究克隆和表达的单加氧酶蛋白具有催化苯甲硫醚活性和较高的对映选择性。

M：marker 1：BL21(pET32a)加IPTG诱导；2、4、6分别为BL21(pET32a-pmmo-3538)、BL21(pET32a-pmmo-3546)、BL21(pET32a-pmmo-6814) 未加IPTG诱导；3、5、7为对应的重组菌加IPTG诱导。

表2 重组菌催化苯甲硫醚转化苯甲手性亚砜结果

序号底物重组菌编号底物浓度(mM)时间(h)ee(%)构型转化率(%)1苯甲硫醚35382240-4．22苯甲硫醚354622499(R)2．93苯甲硫醚681422459(R)8．54苯甲硫醚pET32a2240-2．2

3 讨论

手性亚砜最直接有效的方法是对潜手性的硫醚化合物进行不对称氧化。利用金属[13]和有机小分子[14]作为催化剂不对称氧化硫醚，在反应过程中存在过度氧化、副产物多、反应条件苛刻等弊端[15-16]，而利用微生物细胞或酶(纯酶和微生物体内的酶)催化不对称反应合成手性亚砜，反应条件温和、无需极端温度、压力、强酸和强碱等化学反应必需的条件[17]。另外，酶是有可再生资源制得，自身无毒且能在坏境中降解，并且其具有特殊催化结构的手性催化剂，可与底物特异性的结合，能在温和的条件下实现对手性化合物的高选择性转化。因此，充分利用本实验筛选的菌株结合生物信息学和分子生物手段，充分挖掘海量基因组信息，从中找出可催化硫醚的单加氧酶基因，并构建相应的工程菌，以此作为催化剂催化苯甲硫醚转化为手性亚砜。

本研究从前期的假单胞菌菌株全基因组测序结果选取了3个单加氧酶基因，为便于目的基因与原核表达载体pET32a(+)定向重组，在上游引物的5’端添加 BamHⅠ限制性内切酶酶切位点和4个保护性碱基；下游引物的5’端加入HindⅢ限制性内切酶酶切位点和4个保护碱基，并去除终止密码。酶切位点的选择取决载体的多克隆位点、外源基因序列本身的特性以及后续酶切反应体系。在设计引物添加酶切位点时需要先检查表达外源片段中含有哪些内切酶位点，避免重复。另外需要注意启始密码子和终止密码子的读码框不会移码。重组蛋白在表达时，温和的表达条件利于蛋白的合成缓慢进行，便于蛋白正确折叠，形成更多的可溶性蛋白。

本研究中以构建的工程菌作为催化剂时，转化率较低，表明重组蛋白的催化活性低。重组蛋白的催化活性与酶本身的特性(结构、相对分子质量大小、活性中心构象等)，反应介质，底物和产物等因素息息相关。重组菌表达出的蛋白形式也与催化活性相关，只有可溶性的蛋白具有催化活性，因此，下一步可优化蛋白的表达条件，诱导重组蛋白最大量的可溶性表达。其次，硫醚底物对于生物酶具有一定的毒性，对酶的活性有抑制的作用，因此，寻求高效的生物酶催化硫醚底物的不对称氧化反应研究一直成为一个难点和挑战性的工作。另外，在生物转化反应的过程中，酶所处的环境对于其活性的影响较大，如反应的温度、pH值、反应介质等不适都会使酶的催化活性降低，甚至失去催化活性。所以，后期的研究中可对生物转化反应过程中的条件加以优化，以提高其催化活性。

本研究从全基因组测序结果中选取了3个单加氧酶基因进行克隆，成功克隆了筛选的基因，其中的2个单加氧酶基因表达的蛋白可催化苯甲硫醚生成R构型的苯甲亚砜，具有一定的对映体选择性，但其催化效率还有待于提供。后期工作中可对蛋白的序列进行定向进化和突变，以提高重组蛋白的催化活性。该工作为后期将深入研究PseudomonasmonteiliiCCTCC M2013683菌株基因组的信息，构建高催化活性和高对映选择性的工程菌。

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[收稿2014-11-26;修回2014-12-17]

(编辑：王福军)

Cloning and expression of monooxygenase genes and their application in the synthesis of phenyl methyl sulfoxide

ZhangHongyan1, 2,ZhenDaijun1,LiChangfu2,YangJiawei2,ChenYongzheng1

(1.School of Pharmacy, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China；2.Department of Biochemistry, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

Objective Cloning and expression of monooxygenase genes ofPseudomonasmonteiliiCCTCC M2013683 were performed to investigate their application in the synthesis of chiral sulfoxides.Methods Based on the genome sequence ofPseudomonasmonteiliiCCTCC M2013683, three monooxygenase genes were selected and specific PCR primers were designed. Afterwards, PCR technology was applied to amplify these genes using genomic DNA as template. Recombinant plasmids pET-32a-pmmo were then constructed and transformed into E. coli BL21 (DE3) for recombinant proteins expression. Finally, the genetically engineered bacteria expressing recombinant monooxygenase proteins were used as biocatalysts to catalyze thioanisole substrate.Results Three target genes were amplified and corresponding plasmids were constructed. Recombinant proteins pmmo-3546 and pmmo-6814 exhibit high activity towards thioanisole to form chiral sulfoxide withR-selectivity.Conclusion Recombinant monooxygenase proteins withR-selectivity catalytic activity for thioanisole were successfully obtained.

monooxygenase;thioanisole;biocatalysis;chiral sulfoxides

国家自然科学基金资助项目(NO：21262051)；贵州省国际合作资助项目(NO：QKHGZ-2011-7017)。

陈永正，男，博士，副教授，研究方向：生物催化与手性合成，E-mail:yzchen@zmc.edu.cn。

Q7

A

1000-2715(2015)01-0049-05