段立群，姚晓东，张 渊， 周旭美

(遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563099)

基础医学研究

石斛复方制剂对小鼠免疫功能的影响

段立群，姚晓东，张 渊， 周旭美

(遵义医学院 药学院，贵州 遵义 563099)

目的 研究石斛复方制剂对小鼠免疫功能的影响。方法 40只小鼠随机分为对照组、石斛复方制剂低剂量组、中剂量组及高剂量组各10只。采用小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验观察石斛复方制剂对小鼠非特异性免疫功能的影响，并测定脾脏、胸腺指数；采用ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验观察石斛复方制剂对小鼠细胞免疫功能的影响。另取40只小鼠，同法分组，采用半数溶血值(HC50)实验考察石斛复方制刘对小鼠体液免疫功能的影响。结果 石斛复方制剂能够显著升高小鼠巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数；提高小鼠的HC50；刺激小鼠脾脏淋巴细胞的增殖。结论 石斛复方制剂对小鼠的非特异性免疫、细胞免疫和体液免疫功能均有不同程度的增强作用。

石斛复方制剂；小鼠；免疫功能

金钗石斛为兰科石斛属植物，是我国的名贵中药，《神农本草经》中列为上品，其性寒、味甘，具有滋阴清热、生津养胃、润肺止咳，名目强身等功效，因其特殊的生存环境和明显的滋补功效而享有“民间仙草、植物黄金”的美誉[1]，其主要有效成分为多糖和生物碱[2]。现代药理学研究表明，石斛具有治疗眼病、抗衰老及免疫调节、收缩肠管、抗肿瘤和抗菌等[3-5]功效；黄芪具有免疫促进剂或调节剂的作用，同时具有一定的抗病毒、抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗应激、抗氧化等[6]作用；党参具有健脾益肺、养血生津[7]之功效。石斛复方制剂由金钗石斛(产自贵州赤水)、党参及黄芪3味药材合理组方而成，本实验旨在考察石斛复方制剂对小鼠免疫功能的影响，为石斛复方制剂进一步开发利用奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 金钗石斛(贵州赤水)、党参(山西)、黄芪(内蒙)，经遵义医学院附属医院药剂科杨建文教授鉴定为Dendrobiumnobile Lindl.、Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.、Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. varmongholicus(Bge.)Hsiao。石斛复方制剂(3种药材的用量分别为金钗石斛15g、党参25g、黄芪25g，用40倍量水，80 ℃提取3次，每次2.0 h，减压浓缩至1 g/mL)、20%(v/v)鸡红细胞、生理盐水、Giemsa染液、甲醇、丙酮、20%(v/v)绵羊红细胞(批号 20131119，郑州九龙生物制品有限公司)、SA液、补体(8只豚鼠的混合血清)、都氏试剂、Hank’s液、RPMI-1640培养基、100 μg/mL刀豆蛋白A(ConA)、盐酸、异丙醇、小牛血清、青霉素、链霉素、5 mg/mL MTT(批号 M8180，250 mg)。

1.1.2 仪器 SartoriusBS224S电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)、TU-1901型双光束紫外可见分光光度计(北京谱析通用仪器有限公司)、D-37520离心机(Thermo Fisher Scientific)、DK-2000-IIIL电热恒温水浴锅(天津泰斯特仪器有限公司)、SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台(苏州净化设备有限公司)、Olympus IX71型倒置相差显微镜及成像系统、Thermo 3131型CO2培养箱(Thermo Fisher Scientific)、Thermo 3001-1913型酶标仪(Thermo Fisher Scientific)。

1.1.3 实验动物 清洁级Balb/c小鼠，雄性，18～22 g，由中国人民解放军第三军医大学实验动物中心提供，许可证号20120003。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 40只小鼠随机选取10只为对照组，石斛复方制剂高剂量组(HD)、中剂量组(MD)及低剂量组(LD)各10只。低、中、高剂量依次为3.5、6.0及8.5 g·kg-1。对照组给以0.3 mL蒸馏水。每日灌胃1次，连续给药30 d。另取40只小鼠，同法分组及给药，用于半数溶血值的测定。

1.2.2 小鼠腹腔巨噬细胞吞鸡红细胞实验[8]第30天给药后2 h，每只小鼠腹腔注射20% CRBC (鸡红细胞)1 mL，轻揉腹部，1 h后，颈椎脱臼处死小鼠，将其仰位固定于鼠板上，正中剪开腹部，腹腔给予生理盐水1 mL，旋转鼠板，使腹腔液与生理盐水混匀，注射器吸取腹腔液，分别滴于2片载玻片上，置37 ℃孵箱温育1 h，孵毕，生理盐水漂洗，晾干，固定液(甲醇:丙酮=1∶1)固定1 min，漂洗，Giemsa染液染色3 min，漂洗，将染色载玻片放于烘箱中烘干，油镜下观察小鼠腹腔巨噬细胞吞鸡红细胞情况并计数，每张载玻片计数100个巨噬细胞，按下式分别计算吞噬百分率和吞噬指数。

1.2.3 石斛复方制剂对小鼠免疫器官的影响[9]第30天给药后称重，2 h后颈椎脱臼处死小鼠，取小鼠的胸腺、脾脏称重，按下式分别计算脏器指数。

1.2.4 ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验[8]将小鼠脱颈椎处死，无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的平皿中，用镊子除去多余组织，用剪刀将脾脏剪碎，经200目筛网过滤，成单细胞悬液，用Hank’s液洗1次，之后用等体积培养基洗1次，1 500 r/min，每次离心10 min，弃去上清液，加入2 mL完全培养基，重悬细胞，移取10 μL细胞悬液，用完全培养基稀释20倍，移取稀释后的细胞悬液20 μL于计数板上，用台酚兰染色计数活细胞数，调整细胞浓度为3×106个/mL。将每一份调整好细胞浓度的脾细胞悬液分2孔加入到24孔培养板中，每孔1 mL，其中一孔加入75 μL ConA液，另一孔作为对照，置37 ℃、5% CO2培养箱中培养68 h后，取出培养板，每孔轻轻吸去上清液0.7 mL，加入0.7 mL不完全培养基，同时每孔加入MTT 50 μL，继续培养4 h。培养结束后，每孔加入1 mL酸性异丙醇，用移液器吹打均匀，使紫色结晶完全溶解，然后分装到96孔培养板中，每孔做3个平行孔，酶标仪在570 nm处测定各孔光密度值。加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值即代表淋巴细胞的增殖能力。

1.2.5 半数溶血值(HC50)的测定[8]每只小鼠腹腔注射2% SRBC (绵羊红细胞)0.2 mL，免疫5天，第30天给药后90 min，摘除眼球取血于1 mL EP管内，静置2.0 h，2 000 r/min离心10 min，取血清用SA缓冲液稀释200倍，取稀释后的血清1 mL于4 mL EP管内，依次加入10% SRBC 0.5 mL、补体1 mL (用前用SA缓冲液按1:8稀释)，另设不加血清(用SA缓冲液代替)的对照管作为空白，置37 ℃恒温水浴中保温30 min，冰浴终止反应，2 000 r/min离心10 min。取上清液1 mL，加都氏试剂3 mL于试管内，同时取10% SRBC 0.25 mL于另一试管，加都氏试剂至4 mL，充分混匀，放置10 min。于540 nm处分别测定各管的光密度值，按下式计算HC50。

2 结果

2.1 石斛复方制剂对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 与对照组比较，对吞噬百分率的影响，中、高剂量组显著高于对照组(P<0.05)，分别较对照组提高了21.86%、40.08%；对吞噬指数的影响，低、中、高剂量组均显著高于对照组(P<0.05)，分别较对照组提高20.95%、25.69%、45.45%。在油镜下观察：空白组吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数很少，基本没有吞噬2个以上鸡红细胞，且巨噬细胞较为分散；而给药组吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数较多，并随给药剂量的增大而增加，尤其石斛复方制剂高剂量组巨噬细胞聚集现象明显，且吞噬2个以上鸡红细胞的巨噬细胞数较多(见图1，表1)。

A：空白组；B：低剂量组；C：中剂量组；D：高剂量组。

组别剂量(g·kg-1)吞噬率(%)吞噬指数(%)空白组024．7±4．850．253±0．048石斛复方制剂低剂量组3．529．1±4．860．306±0．048∗石斛复方制剂中剂量组6．030．1±6．84∗0．318±0．069∗石斛复方制剂高剂量组8．534．6±5．85∗∗0．368±0．058∗∗

与空白组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01。

2.2 石斛复方制剂对小鼠免疫器官指数的影响 与对照组比较，对脾脏指数的影响，低剂量组无统计学意义(P>0.05)，中、高剂量组分别较对照组提高了1.95%、2.68%(P<0.05)；对胸腺指数的影响，低剂量组对没有显著变化(P>0.05)，中、高剂量组分别较对照组提高了2.00%、2.37%(P<0.05,见表2)。

组别剂量(g·kg-1)脾脏指数(mg·g-1)胸腺指数(mg·g-1)空白组04．089±0．0781．201±0．030石斛复方制剂低剂量组3．54．158±0．1021．222±0．027石斛复方制剂中剂量组6．04．169±0．094∗1．225±0．020∗石斛复方制剂高剂量组8．54．199±0．044∗∗1．229±0．018∗

与空白组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01。

2.3 石斛复方制剂对小鼠细胞免疫功能的影响 与对照组比较，低剂量组没有显著变化(P>0.05)，中、高剂量组均有统计学意义(P<0.05,见表3)。

2.4 石斛复方制剂对小鼠体液免疫功能的影响 与对照组比较，低剂量组没有统计学意义(P>0.05)，中、高剂量组均可使小鼠的抗体水平明显增高(P>0.05，见表4)。

组别剂量(g·kg-1)淋巴细胞增殖能力空白组00．189±0．022石斛复方制剂低剂量组3．50．203±0．012石斛复方制剂中剂量组6．00．205±0．015∗石斛复方制剂高剂量组8．50．207±0．016∗

与空白组比较，*P﹤0.05。

组别剂量(g·kg-1)血清溶血素(HC50)空白组0119．97±8．73石斛复方制剂低剂量组3．5127．29±9．17石斛复方制剂中剂量组6．0129．56±9．46∗石斛复方制剂高剂量组8．5132．18±11．10∗∗

与空白组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01。

3 讨论

石斛复方制剂系有金钗石斛、黄芪、党参3味药材组成，其中，金钗石斛具有抗衰老及免疫调节的作用[1]；黄芪为扶正固本的常用中药，具有增强机体免疫功能、抑制流感等多种病毒所致细胞病变；促使细胞生长旺盛等作用[10]；党参具有抗肿瘤、增强免疫力的作用，能够起到补中益气，健脾益肺之功效[11]。该复方制剂以金钗石斛益气生津、滋阴清热为主，辅以党参补中益气，健脾益肺，黄芪补气行血。诸药合用，清除机体虚热，平补气血，通过多种途径增强机体免疫功能。本实验从小鼠的非特异性免疫、体液免疫、细胞免疫功能等方面研究了石斛复方制剂对小鼠免疫功能的影响。

巨噬细胞是一种非特异性免疫细胞，也是一种典型的炎症细胞，能够吞噬和消灭外来异物以及自身死亡的细胞，因此，巨噬细胞吞噬活性的大小在一定程度上反应了机体的非特异性免疫功能，利用巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验，可以在体外观察巨噬细胞的吞噬功能。本实验结果表明，各剂量组均能明显提高小鼠巨噬细胞的吞噬指数，而中、高剂量还能够显著提高小鼠巨噬细胞的吞噬率。

胸腺和脾脏是动物重要的免疫器官，其重量也在一定程度上反映了机体的免疫功能。本实验结果显示，中、高剂量复方制剂均能使小鼠的胸腺指数和脾脏指数明显增加。

T淋巴细胞受到ConA刺激后发生母细胞增殖反应，增殖细胞中的线粒体水解酶可将MTT分解为兰紫色结晶，其光密度值反映了淋巴细胞的增殖能力。本实验结果显示，中、高剂量复方制剂能够显著增强小鼠淋巴细胞的增殖能力。

用绵羊红细胞(SRBC)免疫小鼠数天，能够刺激小鼠B细胞产生抗SRBC抗体，用免疫后的小鼠血清在体外与定量SRBC作用，小鼠血清对SRBC的溶解能力(HC50)反映了小鼠抗体分泌细胞分泌抗体的能力，本实验结果可见，中、高剂量复方制剂能够明显增强小鼠抗体分泌细胞分泌抗体的能力。

综上所述，石斛复方制剂能够提高小鼠非特异性和特异性免疫功能，具有显著的免疫增强作用，可作为一种免疫调节剂使用，增强机体的免疫功能，有良好的开发应用价值。

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[收稿2014-09-25;修回2014-11-07]

(编辑：谭秀荣)

Immunological effect of caulis dendrobii compound preparation in mice

DuanLiqun,YaoXiaodong,ZhangYuan,ZhouXumei

(School of Pharmacy, Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China)

Objective To study immunological effect of caulis dendrobii compound preparation in mice.Methods 40 mice were randomly divided into 4 groups: Normal Group (NG), Low Dose Group of CDCP (LDG), Medium Dose Group of CDCP (MDG) and High Dose Group of CDCP (HDG), 10 mice each group. The nonspecific immunological effect of Caulis dendrobii compound preparation in mice was carried out by macrophages swallowed erythrocyte, and by the spleen and thymus index. The cellular immunity activity in mice was tested using Con A-induced spleen lymphocyte transformation test. Another 40 mice were treated as above, and the humoral immune effects were tested using HC50.Results Caulis dendrobii compound preparations significantly increased phagocytic rate, phagocytic index, and HC50in mice. In addition, Caulis dendrobii compound preparations stimulated spleen lymphocyte proliferating.Conclusion Caulis dendrobii compound preparations may increase immunological functions to different degrees in mice, including nonspecific immune, humoral immune and cellular immune functions.

Caulis dendrobii compound preparation；mice；immunological function

贵州省科技计划项目(NO：黔科合重大专项字20086002)。

周旭美，女，教授，硕士生导师，研究方向：新药研发，E-mail：546265853@qq.com。

R96

A

1000-2715(2015)01-0041-04