朱 弘，陈敏艳，朱育红

（陕西省兽药监测所，陕西西安710016）

黄连为毛莨科植物黄连Coptis chinensis、三角叶黄连Coptis deltoidea 或云连Coptis teeta 的干燥根茎，分别习称“味连”、“雅连”、“云连”。收载于《中华人民共和国药典》2010 年版1 部与《中华人民共和国兽药典》2010年版2 部，性寒，味苦，主要功能清热燥湿，泻火解毒［1－2］。主要活性成分为黄连生物碱，目前，己从黄连中分离出来的生物碱包含有小檗碱（berberine）、黄 连 碱（coptisine）、表 小 檗 碱（epiberberine）、巴马汀（paimatine）等几十种［3］。黄连与栀子、黄芩、黄柏等药材配伍，组成的方剂黄连解毒散、香薷散、乌梅散等常用中兽药散剂，广泛应用于现代养殖业，疗效可靠。黄连在这些制剂中多为君药，该药材的真假、质量的优劣直接关系到药品的疗效。因此，黄连的检验成为控制其质量的重要手段。通常检验黄连采用薄层色谱法的展开系统为苯－乙酸乙酯－甲醇－异丙醇－浓氨试液（12∶6∶3∶3∶1），色谱图中4个主斑点清晰，分离度好。黄连解毒散、香薷散、乌梅散3种成方制剂的现行质量标准《中华人民共和国兽药典》2010年版2部中，黄连的色谱鉴别也用的是该系统。但此展开系统中含有苯。苯（C6H6）是无色易挥发液体；沸点80.1 ℃，有芳香气味，比重0.879，不溶于水，溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。苯的毒性大，对中枢神经及血液影响大，对人体具有致癌作用。本试验以黄连解毒散、香薷散、乌梅散为对象，研究了黄连薄层色谱鉴别无苯展开系统，以降低展开试剂中苯对人体的危害及环境的污染，同时为完善黄连薄层色谱鉴别方法提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品 黄连解毒散、香薷散、乌梅散样品（参照《中华人民共和国兽药典》2010年版2部在实验室自制，药材均购自西安市怡康药店）；黄连对照药材（批号z0010704）、盐酸小檗碱对照品（批号z0221206，含量为94.5%），中国兽医药品监察所产品。

1.1.2 仪器 CAMAG 薄层色谱仪，Linomat－5半自动点样仪、ADC 2全自动展开仪、TLC Visualizer数码成像系统，CAMAG 公司产品；BSA2202S型电子天平，赛多利斯科学仪器有限公司产品；BP211D双量程电子天平，Sartorius公司产品，KQ－500DE型超声提取器，昆山市超声仪器有限公司产品；LABOROTA4001型旋转蒸发仪，德国海道尔夫公司产品；硅胶G 薄层板（thin layer plate）规 格10 cm×20cm，批 号20140320，青岛胜海精细硅胶化工有限公司产品。

1.1.3 主要化学试剂 氧化铝，西安化学试剂厂产品，苯、乙酸乙酯、甲醇、异丙醇、三氯甲烷等溶剂均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 溶液制备

1.2.1.1 黄连解毒散供试品溶液制备 称取本品粉末1.3g，置100mL具塞锥形瓶中，加甲醇20mL，加热回流15min，放至室温，用铺有滤纸与氧化铝的滤器滤过，滤液作为供试品溶液1。

1.2.1.2 香薷散供试品溶液制备 称取本品粉末2g，置100mL具塞锥形瓶中，加甲醇20mL，超声处理（功率500 W，频率40kHz）15min，过滤，滤液作为供试品溶液2。

1.2.1.3 乌梅散供试品溶液制备 称取本品粉末0.5g，置100mL具塞锥形瓶中，加甲醇10mL，加热回流15min，滤过，滤液浓缩至5mL，作为供试品溶液3。

1.2.1.4 对照药材溶液的制备 称取黄连对照药材0.2g，按照黄连解毒散供试品溶液制备方法，制成对照药材溶液。

1.2.1.5 对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱对照品5mg，加甲醇10mL，制成每毫升含盐酸小檗碱0.5mg的溶液，作为对照品溶液。

1.2.2 4种不同展开系统薄层色谱法试验

1.2.2.1 现行展开系统［苯－乙酸乙酯－甲醇－异丙醇－浓氨试液（12∶6∶3∶3∶1）］ 分别吸取对照品、对照药材和供试品1、2、3五种溶液各2μL，点于同一硅胶G薄层板上，以苯－乙酸乙酯－甲醇－异丙醇－浓氨试液（12∶6∶3∶3：1）为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸内，预饱和30min，展开，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下检视。

1.2.2.2 无苯展开系统筛选 ①无苯展开系统1：分别吸取对照品、对照药材和供试品1、2、3五种溶液各2μL，点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇－醋酸－水（7∶1∶2）为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸内，预饱和30min，展开，取出，晾干，置紫外光（365nm）下检视。②无苯展开系统2：分别吸取对照品、对照药材和供试品1、2、3五种溶液各2μL，点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷－甲醇－氨水（15∶4∶1）为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸内，预饱和30min展开，取出，晾干，置紫外光（365nm）下检视。③无苯展开系统3：分别吸取对照品、对照药材和供试品1、2、3五种溶液各2μL，点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷－乙酸乙酯－异丙醇－甲醇－水－三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）为展开剂，置氨蒸气饱和的展开缸内，预饱和30min，展开，取出，晾干，置紫外光（365nm）下检视。

2 结果

2.1 采用1.2.2.1方法试验结果

3种供试品溶液与对照品溶液色谱相应位置上显一个相同颜色的荧光斑点，与对照药材溶液色谱相应的位置上显4个相同颜色的荧光斑点（图1）。

2.2 采用无苯展开系统1试验结果

3种供试品溶液在与对照品溶液色谱相应位置上，显一个相同颜色的荧光斑点，在与对照药材溶液色谱相应位置上，显相同颜色的荧光斑点，但其中两个斑点不能完全分离，且斑点严重扩散，轮廓不很清晰（图2）。

图1 黄连薄层鉴别图［展开剂：苯－乙酸乙酯－甲醇－异丙醇－浓氨试液（12∶6∶3∶3∶1）］Fig.1 TLC identification chart of Rhizoma coptidis［Developer：benzene－ethyl acetate－methanol－isopropanol－concentrated ammonia solution（12∶6∶3∶3∶1）］

图2 黄连薄层鉴别图［展开剂：正丁醇－醋酸－水（7∶1∶2）］Fig.2 TLC identification chart of Rhizoma coptidis［Developer：butanol－acetic acid－water（7∶1∶2）］

2.3 采用无苯展开系统2试验结果

3种供试品溶液在与对照品溶液色谱相应位置上，虽显一个相同颜色的荧光斑点，但与对照药材溶液色谱斑点分离度不高，其中两个斑点已接近溶剂前沿，Rf值过大（图3）。

图3 黄连薄层鉴别图［展开剂：三氯甲烷－甲醇－氨水（15∶4∶1）］Fig.3 TLC identification chart of Rhizoma coptidis［Developer：chloroform－methanol－ammonia（15∶4∶1）］

2.4 采用无苯展开系统3试验

3种供试品溶液在与对照品溶液色谱相应位置上，显一个相同颜色的荧光斑点，在与对照药材溶液色谱相应的位置上，显4个相同颜色的荧光斑点，且斑点分离度高，清晰可辨（图4）。

图4 黄连薄层鉴别图［展开剂：环己烷－乙酸乙酯－异丙醇－甲醇－水－三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）］Fig.4 TLC identification chart of Rhizoma coptidis［Developer：cyclohexane－ethyl acetate－isopropanol－methanol－watertrimethylamine（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）］

3 讨论

薄层色谱法是一种简便、快速、微量的分析方法。在薄层色谱中展开系统是决定薄层色谱分离效果的重要因素。其主要根据被分离物质的极性、吸附剂的活度和展开剂的极性进行选择，通过组分分子与展开剂分子争夺吸附剂表面活性中心而得到分离［4－5］。《中华人民共和国兽药典》2010年版2部中兽药成方制剂黄连解毒散、香薷散、乌梅散中黄连薄层色谱鉴别所用展开剂都有苯，由于苯属一类溶剂，对人体和环境的危害很大，国内外实验室均已避免使用。2005年版《中国药典薄层色谱彩色图谱集》中已经将苯改为甲苯，但该展开系统不稳定，存在重现性差的问题［6］。在选择合适的展开系统时，应根据展开系统特性，使被分离混合物全分离，且易进行进一步的定量分析［7］。本次在黄连解毒散、香薷散、乌梅散中黄连薄层色谱鉴别无苯展开系统的研究过程中，我们考察了不同展开剂不同比例的配制方法、溶剂用量、展开剂饱和的时间和样品不同点样量，结果表明，以展开系统3：环己烷－乙酸乙酯－异丙醇－甲醇－水－三乙胺（3∶3.5∶1∶1.5∶0.5∶1）的分离效果良好，斑点清晰。点样量1μL，斑点颜色较淡，不甚清晰；点样量4μL、6μL，则斑点颜色太重，分离不好，有拖尾现象；点样量2μL，斑点颜色适中，且轮廓清晰，分离度高。该方法重现性好，专属性强，能快速、准确地检测黄连解毒散、香薷散、乌梅散中黄连的真伪，有效监控药品质量。且展开系统去除了“苯”试剂，降低试剂对试验操作者的毒害，对人体的健康和保护环境起着积极作用，可为黄连解毒散、香薷散、乌梅散和有关黄连等其他成方制剂薄层色谱鉴别提供参考。

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典2010年版1部［M］.北京：中国医药科技出版社，285.

［2］ 中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典：2010 年版2 部［M］.北京：中国农业出版社，2011：417.

［3］ 赵 楠，李隆云，白志川.中药材黄连的研究现状与展望［J］.重庆理土大学学报，2015，29（1）：53－58.

［4］ 刘子瑶，孙姝雯，肖海英，等.浅析TLC中新型展开剂的选择和替代方法［J］.中国中医药现代远程教育，2011，9（1）：222－223.

［5］ 孙 莉，唐 超，冷一平.薄层色谱法新型展开剂的研究进展［J］.中国西部科技，2010.12，9（36）：47－48.

［6］ 刘和平，王样红.黄连薄层色谱鉴别方法的改进与《中国兽药典》商榷［J］.中国医学杂志，2009（S）：337－339.

［7］ 刘 红，刘 华.薄层色谱法分离黄连素、咖啡因时展开剂的选择［J］.贵阳医学院学报，2005.8，30（4）：378－381.