罗 斌， 王丽娜， 晚亚雄， 石艳荣， 牛静萍， 罗小峰

(兰州大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生研究所， 兰州 730000)



低温条件下大气PM2.5对大鼠心脏抗氧化能力及炎症反应的影响*

罗 斌△， 王丽娜， 晚亚雄， 石艳荣， 牛静萍， 罗小峰

(兰州大学公共卫生学院劳动卫生与环境卫生研究所， 兰州 730000)

目的：探讨不同低温条件下大气细颗粒物(PM2.5)对大鼠心脏抗氧化能力及炎症反应的影响。方法：将36只健康雄性Wistar大鼠按体重随机分成6组(n=6)，分别给予0℃、10℃及20℃(常温对照)的单纯低温刺激及低温+PM2.5暴露。低温+PM2.5暴露组给予低温刺激及气管滴注PM2.5(每次0.25 ml/8 mg)，单纯低温刺激组和常温组给予无菌生理盐每只每次0.25 ml，间隔48 h，连续3次。末次染毒48 h后处死大鼠，采用试剂盒法测定心肌组织丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、白介素-6(IL-6)及C-反应蛋白(CRP)水平。结果：低温+PM2.5暴露组大鼠心肌组织中MDA、SOD、IL-6及CRP水平显著高于单纯低温组，尤其在0℃时，PM2.5对四指标的影响最为显著(P<0.05)。各单纯气温组间比较时，仅SOD在0℃组降低较为明显，其余指标未出现显著变化。各低温PM2.5暴露组组间比较时，MDA、SOD、IL-6及CRP在0℃的PM2.5暴露组升高最为明显，显著高于其他各组(P<0.05)。交互作用检测未发现低温和PM2.5间存在显著交互作用(P<0.05)。结论：低温刺激可能会增加PM2.5的心脏毒性，使其抑制心肌组织抗氧化能力和促进炎症的发生增加。

低温；大气PM2.5；大鼠心肌组织；抗氧化能力；炎症反应

cold stress； fine particulate matter； rat myocardial tissue； anti-oxidative capacity； inflammatory response

流行病学研究认为急性或长期暴露于大气颗粒物能引起心血管疾病发病和死亡率的急剧增加[1, 2]。这种增加的机制可能为颗粒物暴露引起心血管系统氧化应激损伤和炎症等有关，通过抑制心肌组织抗氧化能力和增加氧化自由基的产生，并引起炎症因子水平的升高，从而诱发心血管疾病[3, 4]。低温作为心血管系统的又一危险因素，它与心血管疾病的增加呈负相关，气温越低心血管疾病危险性越大[5]。据报道低温及大气颗粒物在对心血管系统的影响中存在交互作用，低温能增强PM2.5对心血管系统的毒性作用，造成心血管疾病发病率和死亡率的升高[6]。由此可见，低温刺激下PM2.5的心血管系统毒性可能增强。环境监测数据表明，冷空气扰动发生时会引起大气PM2.5浓度升高。如发生于兰州2014年4月的一次冷空气过程，48 h最低温下降了5℃，最低温达2℃，同时该日兰州地区大气PM2.5浓度高达616 μg/m3。因此，低温刺激下较高浓度的PM2.5暴露是否对心血管系统的影响更大是需要迫切解决的问题。本研究将利用低温刺激与大气PM2.5对大鼠进行联合暴露，并从心肌抗氧化能力及炎症反应的角度来探讨不同低温条件下PM2.5对大鼠的心脏毒性。

1 材料与方法

1.1 PM2.5采集和处理

利用PM2.5采样仪采集兰州地区2014年4～5月大气PM2.5，离地5 m以100 L/min流量连续采集于玻璃纤维滤膜上，剪成1 cm2大小的小块，置于去离子水中超声震荡20 min，重复3次，功率500 W洗脱颗粒物。6层纱布过滤，除去玻璃纤维滤膜。将滤过液于4℃，12 000 r/min，离心20 min，收集下层沉淀液，真空冷冻干燥，于-20℃避光保存。染毒前，利用生理盐水(normal saline，NS)将PM2.5制成悬液，超声振荡15 min, 使悬液混匀并高压灭菌。

1.2 实验动物及分组

36只健康雄性Wistar大鼠购买于甘肃省中医学院实验动物中心，合格证号:SCXK (甘) 2004～0006，体重(209.41±16.33) g。将36只大鼠按体重随机分成6组(n=6)，于室温(20±1)℃、相对湿度40%～60%，空白对照饲养7 d，期间给予充足的水和饲料。6组分别为常温组(20℃)、常温PM2.5染毒组(20℃+PM2.5)、低温刺激组Ⅰ(10℃)，低温刺激组Ⅱ(0℃)、低温刺激Ⅰ+PM2.5染毒组(10℃+PM2.5)、低温刺激Ⅱ+PM2.5染毒组(0℃+PM2.5)

1.3 低温刺激及PM2.5染毒

适应性饲养后，6组大鼠随机接受不同的处理因素。具体暴露过程为：将大鼠放于气象环境模拟箱中，给予低温刺激4 h(气压及相对湿度同空白对照)，期间第2小时乙醚麻醉大鼠，并通过气管滴注给予PM2.5组无菌PM2.5悬液(预降温，每次8 mg/0.25 ml)染毒，而给予单纯低温组无菌NS每只每次0.25 ml，间隔48 h，连续染毒3次。

1.4 心肌组织匀浆制备及指标测定

末次低温刺激和PM2.5暴露48 h后，腹腔注射水合氯醛(5%，0.6 ml/kg)，通过腹主动脉终末采血法处死大鼠，立即摘取心脏并称重，按照1∶9生理盐水利用匀浆器在冰浴中将其制成10%组织匀浆，4℃ 3 000 r/min离心20 min，取上清液分装成5管，保存于-80℃，分别用于测定组织匀浆中总蛋白、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及丙二醛(malonaldehyde，MDA)(南京建成生物工程研究所)，C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)及白介素-6(interleukin-6，IL-6)(RD Systems，Inc)。具体步骤严格按照试剂盒说明书操作。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠心肌组织抗氧化能力的变化

MDA在0℃及10℃的PM2.5暴露组均显著高于相应单纯低温刺激暴露组(P<0.05)，而且在0℃的PM2.5暴露组显著高于常温PM2.5组(P<0.05)。MDA在各单纯气温刺激组间并无显著差异。在SOD的结果中，0℃的PM2.5暴露组明显低于相应单纯低温刺激组及其他PM2.5暴露组(P<0.05)，而且在0℃单纯低温刺激组也明显低于常温对照组(P<0.05，表1)。尽管交互作用检验没有发现显著的交互作用，但这些结果可能提示PM2.5暴露在低温时对大鼠心脏抗氧化能力影响更强。

Tab. 1 SOD and MDA level of myocardial tissue in cold stress alone groups and cold stress combined PM2.5 exposure groups

GroupsSOD(mgprot/ml)MDA(nmol/mgprot)20℃+saline2547.46±460.670.88±0.2120℃+PM2.52338.38±256.011.00±0.1010℃+saline2328.98±253.860.94±0.1110℃+PM2.52250.16±534.381.21±0.26*0℃+saline1991.52±273.52#1.06±0.09#0℃+PM2.51676.65±130.11*Δ1.29±0.28*Δ

SOD： Superoxide dismutase; MDA： Malondialdehyde

*P<0.05vscorresponding cold stress alone group；#P<0.05vsgroup of 20℃+saline；ΔP<0.05vsgroup of 20℃+PM2.5

2.2 各组大鼠心肌组织炎症因子CRP和IL-6的影响的变化

IL-6及CRP在0℃的PM2.5暴露组浓度最高，显著高于常温20℃PM2.5暴露组(P<0.05)，并且高于相应单纯低温刺激组(P<0.05)，各单纯低温刺激组间并无显著差异。在10℃组及常温组，CRP在PM2.5暴露组显著高于相应单纯低温刺激组(P<0.05)。尽管交互作用检验未发现显著的交互作用，但上述结果提示PM2.5暴露在低温时对大鼠心脏炎症因子影响更大。

Tab. 2 IL-6 and CRP level of myocardial tissue in cold stress alone groups and cold stress combined PM2.5 exposure groups

GroupsIL-6(pg/ml)CRP(pg/ml)20℃+Sa-line16.25±1.46251.37±11.4320℃+PM2.517.25±0.83261.45±4.23*10℃+Sa-line16.19±0.96246.69±10.2210℃+PM2.516.9±2.35261.18±16.86*0℃+Saline17.53±1.16248.22±11.650℃+PM2.518.98±1.28*#285.46±18.76*#

IL-6: Interleukin-6； CRP: C-reactive protein

*P<0.05vscorresponding cold stress alone group；#P<0.05vsgroup of 20℃+PM2.5

3 讨论

MDA含量的高低间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度，而SOD可以清除机体内的自由基如O2、H2O2，缺乏或耗竭SOD会促使许多有毒化学物质或不良环境因素对机体产生中毒作用或加重其中毒作用。因此,心肌组织中MDA和SOD的含量是衡量心肌组织氧化损伤和抗氧化能力大小的重要指标。IL-6与CRP作为典型的炎症因子，能反映机体炎症的发生情况。赵金镯等发现PM2.5能够引起WKY及SHR大鼠心肌组织中CRP及IL-6等炎症因子水平的升高，并引起心肌细胞内SOD活性下降及MDA的升高[7]。这与本研究的结果相似。本研究结果提示PM2.5暴露组大鼠心肌组织中MDA和SOD含量分别高于和低于非PM2.5暴露组，而且IL-6和CRP也显著高于非PM2.5暴露组，说明急性PM2.5暴露不仅引起大鼠心肌组织氧化损伤和抗氧化功能的抑制，而且还引起了心脏的炎症反应。低温引起心血管疾病事件的发生增加，尤其是冷空气过程会造成心血管疾病发生率和死亡率的急剧升高[8]。以往研究发现冷空气过程可能通过升高血压及其他危险因子如血压、血脂、血纤维蛋白原等来增加心血管疾病危险[9, 10]。本研究中，低温刺激除引起心肌组织SOD显著的降低外，其他指标并未出现明显变化。因此，可以认为低温刺激还可能会通过降低心肌的抗氧化能力来增加心血管疾病危险性。

研究认为低温能够增加PM2.5对心血管疾病的影响，引起心血管疾病发生和死亡的增加，但其机制尚不清楚。本实验利用低温刺激与PM2.5进行联合毒理实验，结果提示低温(0℃)时，PM2.5对大鼠心肌组织SOD、MDA、IL-6及CRP影响显著。尽管交互作用检验并不显著，但该结果提示较低气温刺激可能会增加PM2.5对心血管系统的影响，并通过增加PM2.5暴露对心肌组织抗氧化能力的抑制和促进炎症的发生而发生。PM2.5主要通过呼吸系统进入体内，粒径较小的颗粒甚至通过肺泡毛细血管进入心脏中，从而对心脏产生毒性作用[11]。低温刺激可能会抑制呼吸系统对PM2.5的防御，如低温刺激可以破坏气道纤毛结构[12]，并降低肺泡巨噬细胞的吞噬能力[13]。因此低温刺激可以抑制气道纤毛对PM2.5的清除及肺巨噬细胞等吞噬细胞对PM2.5的吞噬作用，从而使得进入体内的PM2.5增加。此外，低温刺激还能引起心脏的其他毒性作用，如引起抗氧化能力下降，心血管疾病危险因子增加，从而加重PM2.5对心脏的毒性作用[9, 14]。

综上所述，低温刺激可能会增加PM2.5的心脏毒性，使其抑制心肌组织抗氧化能力和促进炎症的发生增加。

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国家自然科学基金资助项目(41405108)；兰州大学中央高校基本科研业务费专项资金项目(861495)

2014-09-23 【修回日期】2014-11-07

R122

A

1000-6834(2015)01-011-03

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.004

△【通讯作者】Tel: 13919783313； E-mail： luob@lzu.edu.cn