夏小慧， 夏惠芸， 郭 洁， 刘康超， 胡 扬

(1. 兰州城市学院， 2. 国营长风机器厂职工医院， 甘肃 兰州 730070； 3. 北京体育大学， 北京 100084)



HSL基因重复多态与有氧耐力的关联性*

夏小慧1， 夏惠芸2， 郭 洁1， 刘康超1， 胡 扬3△

(1. 兰州城市学院， 2. 国营长风机器厂职工医院， 甘肃 兰州 730070； 3. 北京体育大学， 北京 100084)

目的：探讨激素敏感性脂肪酶(HSL)基因重复多态与有氧耐力之间的关联性。方法：采用PCR结合荧光标记复合STR-genescan方法，对123名中国北方汉族优秀长跑运动员与127名中国北方汉族普通大学生HSL基因第6内含子区(CA)n 重复多态基因分型进行检测，对重复多态按分割点进行分组，划分为长、短链两个等位基因，卡方检验比较运动员组和对照组间等位基因频率和基因型频率差别。结果：HSL基因(CA)n重复多态共有9种不同重复次数的等位基因，组成25种不同基因型。卡方检验结果显示，当以4重复次数为分割点划分短链和长链等位基因进行比较时，基因型的分布在5/10 km组与对照组相比，有显著性差异(P<0.05)。其余各组间进行比较，均无显著性差异。结论：HSL基因第6内含子(CA)n重复多态，当以4重复次数为分割点划分短链和长链等位基因进行比较时，LL基因型与有氧耐力相关联，可能是5/10 km运动员的分子标记。

HSL；基因多态性；有氧耐力；分子标记

在人体的能源系统中，与糖储备相比，内源脂肪是一种相对无限的能源。而激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive triglayceride lipase,HSL)，是脂肪分解的限速酶[1]，能水解甘油三酯、甘油二酯、甘油一酯等，产生脂肪酸。脂肪动员和脂肪利用能力的提高，对改善运动能力，尤其是耐力运动水平有着重要的作用[2,3]。

有氧耐力是一项遗传度较高的运动能力。近年来，大量研究通过对与有氧耐力相关的基因多态位点的研究，筛选出了多个与有氧耐力运动能力相关联的遗传学分子标记[4-6]，研究结果为将来依据遗传学标记进行优秀有氧耐力运动员的基因选材提供了依据。HSL基因是通过调节脂肪动员，从而影响有氧耐力表型的微效基因，其基因多态位点可能是影响有氧耐力的遗传学因素。因此，本研究在HSL基因区选择位于第6号内含子处代表性多态位点(CA)n，通过对比多态位点在优秀耐力运动员与普通人群中的分布不同，探讨其作为影响有氧耐力遗传标记的可能性。

1 对象与方法

1.1 研究对象

运动员组123人，年龄23.10±5.10岁，其中男性56人，女性67人。运动专项为5/10 km或马拉松跑，运动等级为健将或国际健将；普通人组127人，年龄21.53±1.30岁，其中男性71人，女性56人，均无运动专业训练背景。所有受试者均来自山东、河北、东北三省。所有研究对象均知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 提取基因组DNA 受试者肘静脉取血，从全血中提取基因组DNA。

1.2.2 解析基因型 采用PCR结合荧光标记复合STR-genescan方法解析HSL基因(CA)n 重复多态基因型。根据GenBank提供的HSL序列，用primier 5.0软件设计引物。使用荧光标记物FAM标记上游引物5'端。上游引物：5'AGGCAGAGGAATCTAAG 3'；下游引物：5'CTGAGCGACATGACAC 3'。常规方法进行PCR扩增。

取3 μl扩增产物，用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段大小。合格的PCR产物用于荧光基因扫描方法检测。在ABI-3100DNA 测序仪上进行电泳，以荧光吸收峰表示每个DNA片段。用Genotyper 软件根据同一泳道标准分子量片段(即内标)迁移率计算出每一泳道迁移率的标准曲线，从而得出待测 DNA 片段分子量大小。最后将计算出的待测 DNA片段分子量与等位基因分型标准物比对，得出其基因型。

1.2.3 数据分析 用SPSS 11.5软件统计基因型频率和等位基因频率，对不同分组的位点分布进行哈温平衡检验。运动员组和对照组间等位基因频率和基因型频率差别比较用χ2检验。进一步对重复多态按某个分割点划分为长短链两个等位基因[7]，比较运动员组和对照组间等位基因频率和基因型频率差别。

2 研究结果

2.1 等位基因分布特征

HSL(CA)n重复多态PCR产物片段长度与扫描分析后的等位基因重复次数检测结果见表1。

Tab. 1 PCR length and repeat times of (CA)n polymorphism(±s， n=10)

基因扫描结果显示，HSL基因(CA)n重复多态共有9种不同重复次数的等位基因，对应于1～9重复次数，116～132 bp PCR片段长度。图1所示为部分HSL基因(CA)n重复多态经基因扫描后FAM标记的吸收峰。(图1A)所示PCR产物长度为124 bp、126 bp，等位基因为(CA)5、(CA)6，基因型为5/6杂合型；(图1B)所示PCR产物长度为120 bp、122 bp，等位基因为(CA)3、(CA)4，基因型为3/4杂合型；(图1C)所示PCR产物长度120 bp、126 bp，等位基因为(CA)3、(CA)6，基因型为3/6杂合型。

Fig.. 1 Genescan of (CA)n polymorphism A: Genetype of 5/6； B: Genetype of 3/4； C: Genetype of 3/6

HSL基因(CA)n重复多态在各组间均符合哈温平衡(P>0.05)。等位基因分布情况见表2。其中，以5次重复等位基因分布频率为最多，在对照组中的分布频率为56%，在运动员中的分布频率为58%。其次为4次和6次重复等位基因，在对照组中的分布频率均为11%，而在运动员组中的分布频率均为13%。

Tab. 2 Distribute features of (CA)n allele

卡方检验结果显示，等位基因的分布在对照组和运动员组没有显著性差异。对运动员组再分层分析，马拉松组、5/10 km组分别与对照组相比，均无显著性差异。按(CA)n不同重复次数为分割点，将(CA)n等位基因划分为≥分割点(长链组)和<分割点组(短链组)进行分析。按分割点分组后的等位基因分布特征见表3。

卡方检验结果显示，当分别以4、5、6、7、8、9重复次数为分割点划分短链和长链进行比较时，等位基因的分布在对照组和运动员组没有显著性差异。对运动员组再分层分析，马拉松组、5/10 km组分别与对照组相比，均无显著性差异。

Tab. 3 Distribute features of (CA)n allele (grouped by segmentation points)

AlleleControl(n=127)Athlete(n=123)5/10km(n=93)Marathon(n=30)≥4223(0.88)226(0.92)172(0.92)54(0.9)<431(0.12)20(0.08)14(0.08)6(0.1)≥5195(0.77)195(0.79)147(0.79)48(0.8)<559(0.23)51(0.21)39(0.21)12(0.2)≥6201(0.79)193(0.78)143(0.77)50(0.83)<653(0.21)53(0.22)43(0.23)10(0.17)≥725(0.1)20(0.08)14(0.08)6(0.1)<7229(0.9)226(0.92)172(0.92)54(0.9)≥818(0.07)10(0.04)6(0.03)4(0.07)<8236(0.93)236(0.96)180(0.97)56(0.93)≥95(0.02)3(0.01)3(0.02)0(0)<9249(0.98)243(0.99)183(0.98)60(1)

2.2 基因型分布特征

HSL基因(CA)n重复多态基因型共25种，在对照组中观察到23种基因型，在运动员组中，观察到19种基因型。分布频率最高的是5/5基因型。在对照组和运动员组中的分布频率分别为35%和33%。在对照组中，没有发现4/9、4/7基因型，在运动员组中，没有发现3/7、3/8、4/8、6/9、7/7、8/8基因型(表4)。

Tab. 4 Distribute features of (CA)n genotype

卡方检验结果显示，基因型的分布在对照组和运动员组没有显著性差异。对运动员组再分层分析，马拉松组、5/10 km组分别与对照组相比，均无显著性差异。将HSL基因(CA)n重复多态的等位基因重复按分割点划分为长短链两个等位基因：即S(短链)等位基因和L(长链)等位基因。则存在三个基因型，即SS、SL和LL。按SS+SL和LL分组分析，即(CA)n重复次数均大于某一分割点组成的基因型为一组，其他基因型为一组，进行两组间比较分析。HSL基因(CA)n基因型按分割点分组后的分布特征见表5。

Tab. 5 Distribute features of (CA)n genotype (grouped by segmentation points)

GenotypeControl(n=127)Athlete(n=123)5/10km(n=93)Marathon(n=30)≥4(LL)97(0.76)105(0.85)81(0.87)*24(0.8)<4(SS+SL)30(0.24)18(0.15)12(0.13)*6(0.2)≥575(0.59)78(0.63)60(0.65)18(0.6)<552(0.41)45(0.37)33(0.35)12(0.4)≥613(0.1)10(0.08)9(0.1)1(0.03)<6114(0.9)113(0.92)84(0.9)29(0.97)≥72(0.02)0(0)0(0)0(0)<7125(0.98)123(1)93(1)30(1)≥81(0.01)0(0)0(0)0(0)<8126(0.99)123(1)93(1)30(1)

*P<0.05vscontrol group

卡方检验结果显示，当以4重复次数为分割点划分短链和长链等位基因进行比较时，基因型的分布在对照组和运动员组没有显著性差异。对运动员组再分层分析，马拉松组与对照组相比，无显著性差异，5/10 km组与对照组相比，有显著性差异(P<0.05)。

当分别以5、6、7、8重复次数为分割点划分短链和长链等位基因进行比较时，基因型的分布在对照组和运动员组没有显著性差异。对运动员组再分层分析，马拉松组、5/10 km组分别与对照组相比，均无显著性差异。

3 讨论

HSL基因位于第6号内含子的(CA)n重复多态分布特征与人种关系密切，是目前研究较多的能量代谢相关位点。Magre等研究表明，白种人HSL第6号内含子(CA)n等位多态中，n=5的等位基因频率在2型糖尿病人中明显升高，且这种关系是不依赖于肥胖的[8]。也有研究表明，该重复多态等位基因5是腹部脂肪细胞的分解代谢速率降低的标记，与肥胖表型密切相关[9，10]。而在我国遵义地区汉族人群中，2型糖尿病患者HSL第6号内含子(CA)n多态的等位基因9与2型糖尿病呈正关联，等位基因5与2型糖尿病呈负关联[11]。由此说明，HSL第6号内含子(CA)n重复次数与能量代谢谢症状相关，但在不同人群中其作用不同。

基因多态性与耐力水平[5]以及运动训练敏感性[3]相关联的研究报道较多。本研究中，在假设P<0.05具有统计学意义的前提下，HSL基因的(CA)n多态当以4重复次数为分割点划分短链和长链等位基因进行比较时，LL基因型在5/10 km运动员与对照组相比，在统计学上有显著性差异。产生这种差异的原因，从基因功能学分析，HSL(CA)n重复多态位于基因第6内含子处，其变异直接对蛋白质的结构与功能产生影响的可能性较小，但有可能会影响基因的剪切或表达，从而影响蛋白质的表达量。由于该基因的功能是促进脂肪的分解，其表达量的改变可能会影响脂肪的分解能力，使循环系统中游离脂肪酸的含量改变，从而影响了长跑运动员的运动能力。另外，有可能HSL(CA)n重复多态本身不会影响相关基因的表达，但其与某一能影响有氧耐力的功能型变异位点位于连锁不平衡，因此，代表另一连锁不平衡位点，成为了一个可检测的遗传标记。

本研究是在假设P<0.05具有统计学意义的前提下进行的关联性分析，其结果提示了可能在相关表型的发生中起作用的分子遗传学标记，为确定我国优秀运动员基因选材的分子遗传学标记提供了参考。即当以4重复次数为分割点划分短链和长链等位基因进行比较时，LL基因型有可能是5/10 km运动员的分子标记，可以作为运动员选材的参考分子遗传学指标。但是遗传标记是否对基因表达真正的产生影响，则需要进行基因功能的深入研究，为关联性研究结果提供直接的实验证据，从而阐明关联机制，这对研究人体运动能力这类复杂表型的发生机理非常重要[12]。

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Studies on association of HSL repeat polymorphism and aerobic endurance

XIA Xiao-hui1, XIA Hui-yun2, GUO Jie1, LIU Kang-chao1, HU Yang3△

(1. Lanzhou City university, 2. the Hospital of Changfeng Machinery Factory, Lanzhou 730070; 3. Beijing Sport University, Beijing 100084, China)

Objective: To investigate the relationship between hormone sensitive lipase (HSL) gene polymorphism and aerobic endurance. Methods: The (CA)n repeats polymorphism genotypes in HSL intro 6 of 123 outstanding long distance runners and 127 controls of Han nationality in northern China were analyzed by PCR and Fluorescence labeled STR-genescan. Repeat polymorphisms were grouped according to segmentation point and alleles were divided into long or short chains. Chi-square test was used to analyze the frequency difference of allelic and genotypic between athlete and control groups. Results: (CA)n repeats polymorphism in HSL gene was total of9 different repeat number of alleles, which composed of 25 different genotypes. The chi-square test result showed that when compared short and long chain alleles split by 4, there was a significant difference (P<0.05) of genotype distribution in 5/10 km group compared with control. Compared the rest groups with control, there was no significant difference. Conclusion: Compared short and long chain alleles split by 4, the LL genotype of (CA)n of HSL was associated with aerobic endurance and it might be a molecular marker of elite 5/10 km long distance runners.

hormone sensitive lipase; polymorphism; aerobic endurance; molecular marker

甘肃省自然科学基金(1208RJZA165)；国家科技攻关计划项目(2003BA904B04)

2014-08-13 【修回日期】2014-10-28

R363.1

A

1000-6834(2015)01-093-04

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.027

△【通讯作者】Tel: 010-62989208； E-mail: hyyr1@163.com