万秋英

(湖北民族学院附属民大医院， 恩施 445000)



五鹤续断总皂苷对AD大鼠学习记忆及海马Ach代谢的影响*

万秋英△

(湖北民族学院附属民大医院， 恩施 445000)

目的：研究五鹤续断总皂苷对AD大鼠学习记忆能力的影响及其作用机制。方法：将40只大鼠随机分为空白对照组、模型组、五鹤续断组和阳性对照组(n=10)，观察各组大鼠一般情况，以方形水迷宫评价大鼠的学习记忆能力，采用双抗体夹心法测定大鼠海马区乙酰胆碱酯酶(AchE)和胆碱乙酰转移酶(ChAT)的活性变化。结果：治疗过程中，模型组大鼠一般情况无明显变化，五鹤续断组和阳性对照组大鼠一般情况逐步改善，活动能力逐渐增强。与空白对照组比，模型组不同时间的游泳时间均明显延长，错误次数显著增多，海马区AchE活性明显增强，ChAT活性显著降低(P<0.01)；与模型组比，五鹤续断组和阳性对照组大鼠不同时间的游泳时间明显缩短，错误次数显著减少，海马区AchE活性明显降低，ChAT活性显著增强(P<0.01)；与阳性对照组比，五鹤续断组不同时间的游泳时间、错误次数和大鼠海马区AchE和ChAT活性无显著性差异。结论：五鹤续断总皂苷能够改善AD大鼠学习记忆能力，其作用机制可能与其调节海马区Ach代谢有关。

五鹤续断总皂苷;阿尔茨海默病；海马；乙酰胆碱酯酶；胆碱乙酰转移酶

随着全球人口老龄化,阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的发病率呈逐年上升趋势，如何有效地防治AD已经成为提高人民群众，特别是老年人群健康水平急待解决的重要课题。但阿尔茨海默病至今病因尚不明确，目前也缺乏特效的防治药物。近年来，有不少学者从中草药中分离出许多天然化合物，其中一些改善痴呆症状比传统药物的作用要好，且副作用较少，被认为是很有前途的抗AD药物[1]，为AD的防治找到了新的突破口。有研究证实续断总皂苷可显著提高斑马鱼的认知和学习能力，中和β淀粉样蛋白神经毒性作用，增加神经元的存活率，减少β淀粉样蛋白沉积引起的细胞凋亡，改善AD患者的痴呆症状[2]，但其机制尚不清楚。本文拟通过观察五鹤续断总皂苷对AD模型大鼠海马区乙酰胆碱酯酶(acetyl cholinesterase，AchE)和胆碱乙酰转移酶(choline acetyltransferase，ChAT)活性的影响,探讨五鹤续断总皂苷防治AD的作用机理，为其在临床上防治AD提供依据。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

五鹤续断总皂苷水溶液的制备： 用95%乙醇提取五鹤续断后, 浓缩提取液至无醇味的浸膏, 水溶解后上大孔吸附树酯柱, 用香草醛-浓硫酸显色反应比色法在波长532 nm测定总皂苷的含量为52.34%，稀释成浓度为0.72 g/L五鹤续断总皂苷水溶液备用。D-半乳糖、三氯化铝(上海恒信化学试剂有限公司)。AchE、ChAT试剂盒(南京建成生物工程研究所)

1.2 主要仪器

UV-2450分光光度仪，GL-20GII型高速低温离心机，Multikan MK3酶标仪，DW40-120低温冰箱，BS224S电子分析天平，HFJ-10内切式匀浆机。

1.3 动物分组及给药

4月龄健康清洁级Wistar大鼠,雌雄各半，体重280～320 g(华中科技大学同济医学院动物中心)，适应性饲养1周后， 经Morris水迷宫测试从50只中选出的40只反应正常的大鼠，随机分为空白对照组、模型组、五鹤续断组和阳性对照组(n=10)。模型组、五鹤续断组和阳性对照组腹腔注射D-半乳糖60 mg/kg·d和灌胃三氯化铝500 mg/kg·d, 空白对照组给予等量生理盐水进行腹腔注射和灌胃，连续造模42 d,采用方形水迷宫判定造模是否成功，以大鼠游完全程到达台阶的时间(游泳时间)显著长于空白对照组(P<0.05)和进入盲端的次数(错误次数)显著多于空白对照组(P<0.05)为造模成功的标准。造模成功后，五鹤续断组分别按100 mg/kg·d连续灌服五鹤续断总皂苷水溶液, 阳性对照组给予目前临床上常用来治疗AD的有效药物脑复康0．5 g/kg·d灌胃，空白对照组和模型组灌服等量生理盐水，连续治疗42 d。

1.4 一般情况观察和神经行为学测试

动物处理过程中每天清晨空腹称重1次，观察大鼠的行动、反应能力和睡眠、饮食状况。按实验要求连续治疗42 d， 末次给药后进行水迷宫训练和测试。方形水迷宫内有4 个盲端, 在终点处有台阶,水深略低于台阶, 水温为(22±2)℃，动物可以通过上岸逃避溺水危险。实验过程中, 保持水迷宫周围光源、物体位置固定不变。训练3 d, 测试4 d。训练由易到难，先将大鼠放在台阶附近，使其自行上岸逃避溺水危险, 然后放在逐渐远离台阶的位置，引导大鼠游至台阶上岸逃避。测试时直接将大鼠放于水迷宫远端，记录大鼠游完全程到达台阶的时间(游泳时间)和进入盲端的次数(错误次数), 120 s不能游出者游泳时间按120 s计。

1.5 大鼠海马区AchE、ChAT活性测定

行为学测试结束后，将大鼠脱颈椎处死，迅速取脑置于冰盘上，分离海马，称重，放入玻璃匀浆器中，加入冷的生理盐水(生理盐水的体积总量是脑组织重量的9倍)，用内切式组织匀浆机制备成10%的脑组织匀浆，低温离心机3 000 r/min离心10～15 min，取适量匀浆上清夜，按试剂盒说明测定并计算海马区AchE、ChAT活性。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 一般情况观察

造模过程中，大鼠逐渐出现少动，行动和反应迟缓，嗜卧，饮食减少，体重下降，并进行性加重；治疗过程中，模型组上述情况无明显改善，五鹤续断组和阳性对照组大鼠一般情况逐步改善，活动能力逐渐增强。

2.2 水迷宫检测结果

各组大鼠游泳时间日渐缩短 错误次数逐渐减少。与空白对照组比，模型组不同时间的游泳时间明显延长，错误次数显著增多(P<0.01)；与模型组比，五鹤续断组和阳性对照组不同时间的游泳时间明显缩短，错误次数显著减少(P<0.01); 与阳性对照组比，五鹤续断组不同时间的游泳时间和错误次数无显著性差异(表1、表2)。

Group1stday2ndday3ird4thdBlankcontrol75.44±5.2167.28±5.6952.02±4.3636.94±3.27Model102.78±8.36**95.66±9.14**74.48±6.05**56.38±4.11**Dipsacus88.92±6.18##78.24±7.65##61.58±5.74##45.20±4.29##Positivecontrol81.54±5.32##72.67±5.44##58.62±4.43##41.98±3.80##

**P<0.01vsblank control group；##P<0.01vsmodel group

2.3 各组大鼠海马区AchE、ChAT活性的比较

与空白对照组比，模型组大鼠海马区AchE活性明显增强，ChAT活性显著降低 (P<0.01)；与模型组比，五鹤续断组和阳性对照组大鼠海马区AchE活性明显降低，ChAT活性显著增强(P<0.01)；与阳性对照组比，五鹤续断组大鼠海马区AchE和ChAT活性无显著性差异(表3)。

Group1std2ndd3rdd4thdBlankcontrol6.1±1.25.4±1.23.9±0.72.2±0.8Model9.7±1.6**9.0±1.5**7.0±1.1**4.8±0.7**Dipsacus7.5±1.3##6.9±1.4##5.1±0.8##3.6±0.4##Positivecontrol6.6±1.3##6.1±2.0##4.6±0.5##3.2±0.7##

**P<0.01vsblank control group；##P<0.01vsmodel group

GroupAchEChATBlankcontrol0.37±0.03100.14±8.26Model0.76±0.09**46.56±4.74**Dipsacus0.49±0.07##82.51±5.38##Positivecontrol0.43±0.06##84.62±7.08##

AchE： Acetyl cholinesterase; ChAT: Choline acetyltransferase

**P<0.01vsblank control group；##P<0.01vsmodel group

3 讨论

中枢胆碱能神经主要分布在海马、纹状体和皮质等部位 ，胆碱能系统与学习记忆密切相关，M胆碱能突触是记忆的物质基础，乙酰胆碱能够促进学习记忆[3]，尽管AD 发病机制非常复杂, 难以用一种假说解释清楚, 但脑内胆碱能神经功能低下被认为是造成AD 的最重要病理因素之一[4]。AD患者脑内ACh水平降低程度与患者认知能力的降低显著相关，提高脑内ACh水平,患者的记忆力认知力就能得到改善[5，6]。在脑内ACh的代谢水平取决于ChAT和AchE的活性，ChAT是Ach的合成酶 ，可以提高Ach的水平，AchE能够降解乙酰胆碱,终止其对突触后膜的兴奋作用[7]。

中医基础理论认为, 肾虚髓衰、脑络痹阻是老年性痴呆的基本病理机制[8]。肾与脑密切相关，肾虚是衰老的基础, 是许多老年性疾病发生的主要原因, 若肾中精气亏虚，脑髓得不到适当的补充， 则出现记忆、智能、精神等方面的障碍[9]。大量的研究证明五鹤续断具有补肝肾、强筋骨、续折伤、止崩漏、安胎等功效[10]。其通过补肾精气，使髓海得养，听觉灵敏，精力充沛，记忆清楚，反应快捷。

本实验通过D-半乳糖联合三氯化铝复制出了胆碱能功能受损而出现痴呆症状的动物模型。连续使用五鹤续断总皂苷水溶液灌胃治疗, 治疗过程中，五鹤续断组和阳性对照组大鼠痴呆症状逐步改善，记忆、认知、活动能力逐渐增强。治疗42 d后检测发现五鹤续断组和阳性对照组大鼠不同时间的游泳时间明显缩短，错误次数显著减少，海马区AchE活性明显降低，ChAT活性显著增强，而五鹤续断组和阳性对照组大鼠不同时间的游泳时间、错误次数和大鼠海马区AchE和ChAT活性无统计学差异。说明五鹤续断总皂苷具有脑复康样抗AD作用，其能促进海马区乙酰胆碱的合成，减少乙酰胆碱的降解，提高ACh的水平，保持神经信号在脑内的正常传递，改善AD大鼠的学习记忆能力，对预防和治疗AD有良好的应用前景。

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Effect of Dipsacus total saponins on the ability of learning and memory and acetylcholine metabolism of hippocampus in AD rats

WAN Qiu-ying△

(Affiliated Hospital of Hubei Institute for Nationalities, Enshi 445000, China)

Objective: To study the effects of Dipsacus total saponins on the ability of learning and memory and its mechanism of action. Methods: Forty rats were randomly divided into blank control group, model group，Dipsacus group and positive control group (n=10), general situation of rats were observed, the ability of learning and memory of rats was tested by Square water maze, the activities of acetylcholinesterase (AChE)and choline acetyltransferase (ChAT) of hippocampus in rats were measured using double antibody sandwich method. Results: During the period of treatment, general situation had no obvious change in model group, but general situation and the ability of activity were gradually improved in Dipsacus group and positive control group. Compared with blank control group, the swimming time was obviously prolonged and the number of mistakes was obviously increased at different time, the activity of AChE was significantly enhanced and the activity of ChAT was significantly decreased in model group. Compared with model group, the swimming time was obviously shortened and the number of mistakes was obviously reduced at different time, the activities of AChE were significantly decreased and the activities of ChAT were significantly enhanced in Dipsacus group and positive control group； Compared with positive control group, the swimming time and the number of mistakes at different time and the activities of AChE and ChAT had no significant difference in Dipsacus group. Conclusion: Dipsacus total saponins can improve the ability of learning and memory in Alzheimer's disease(AD) rats, its mechanism of action may be related to regulating ACh metabolism of hippocampus.

dipsacus total saponins； Alzheimer’s disease; hippocampus; acetylcholinesterase； choline acetyltransferase

2014-06-20

2014-10-20

R285.5

A

1000-6834(2015)01-082-03

10.13459/j.cnki.cjap.2015.01.024

△【通讯作者】Tel： 15671534176; E-mail： 907903154@qq.com