武孔焕，吴文卫，刘 昂，陈丽梅，李昆志

（1.云南高原湖泊流域污染过程与管理重点实验室 （筹），云南省环境科学研究院，云南昆明，650034；2.昆明理工大学，云南昆明650500）

钒酸盐预处理对美人蕉吸收农田废水中硝态氮效率的影响

武孔焕1，吴文卫1，刘 昂2，陈丽梅2，李昆志2

（1.云南高原湖泊流域污染过程与管理重点实验室 （筹），云南省环境科学研究院，云南昆明，650034；2.昆明理工大学，云南昆明650500）

以美人蕉为实验材料，用质膜H＋－ATPase活性抑制剂VA处理美人蕉，考察VA对美人蕉根部质膜H＋－ATPase活性与吸收硝态氮效率的影响。研究结果表明：100μM VA预处理显著降低美人蕉对农田废水中硝态氮的吸收，质膜H＋－ATPase和H＋－泵活性也显著降低。

农田废水处理；美人蕉；钒酸盐预处理；硝态氮效率；预处理影响

杞麓湖是云南省九大高原湖泊之一，位于玉溪市通海县的中北部，东经102°33′48′′～102°52′36′′，北纬24°4′36′′～24°14′21′′。近年来，由于流域经济的发展、人口的不断增加，部分污染物直接排入杞麓湖，使得湖体水质受到严重污染。

在植物的不同器官中，根系发挥着重要的作用，包括各种营养物质的吸收、运输。根系不仅能吸收利用土壤的养分，还为植物的生长提供能量。植物的根系形态特征、生理特征都和根系对氮素的吸收有着密切关系。根系形态的发达与否，决定着其对氮素的吸收效率。植物根系吸收氮素最主要的形态之一是氮素的硝态氮形态，因为土壤胶体不易吸附硝态氮，所以硝态氮能被所有的植物吸收并加以利用［1］。

质膜H＋－ATPase是一种膜蛋白，在多种植物质膜和各种内膜系统中都广泛存在，在细胞的生物代谢过程中，发挥着重要作用，参与多种代谢反应。14－3－3蛋白通过与质膜上的主要靶结合位点质膜H＋－ATPase结合，从而增加其活性，以启动相应的反应。有研究表明，钒酸盐 （VA）能够竞争性抑制质膜H＋－ATPase活性，从而影响植物吸收硝态氮的效率。本研究以美人蕉为实验材料，用质膜H＋－ATPase活性抑制剂VA处理美人蕉，考察抑制剂对美人蕉根部质膜H＋－ATPase活性与吸收硝态氮效率的影响。

1 材料与方法

1.1 美人蕉的培养

农田废水的采样点位于杞麓湖北岸，按照相关规定采集后的农田废水存放于4℃冷库，保存备用。

本研究所用实验材料为美人蕉（Cana），将美人蕉幼苗培养在湿地中，当其株高长至30～40cm的时候，小心挖出并注意保护根部的的完整性，用自来水清洗干净根部，放于盛有5L自来水的容器中水培，并且每隔2d更换一次自来水，培养30d左右，可见美人蕉根部新根长出，该植株用于后续实验。

1.2 农田废水成分的测定

1.2.1 农田废水pH的测定

用烧杯取100mL存放于4℃冷库中保存备用的农田废水样品，室温放置30min，使其温度上升至室温。使用成都瑞驰分析仪器有限公司PHS－2C型pH计测定水样pH。

1.2.2 农田废水NO3－浓度的测定

NO3－的测定用酚二磺酸分光光度法［3］，单位：mg／L。

1.2.3 农田废水PO43－浓度的测定

PO43－的测定用钼锑抗分光光度法［3］，单位：mg／L。

1.3 抑制剂VA预处理后美人蕉最适浓度的筛选

参照1.1方法培养美人蕉，分别用不同浓度的VA溶液（50μM、100μM、150μM）的VA预处理美人蕉12h，然后置于3L农田废水中处理6、12、24h（此组实验作为实验组）（VA）；经农田废水处理后测定美人蕉对硝态氮的吸收效率。结果发现100μM的VA预处理美人蕉对硝态氮的吸收效果增加较为显著，因此选取VA的浓度100μM用于后续实验。同时选取美人蕉外部形态大致相似的不经过VA预处理的作为对照组（CK），但需同样置于3L农田废水中处理6、12、24h。在农田废水处理的不同时间点收集美人蕉根部0.5g保存备用，用于检测美人蕉对硝态氮的吸收效率、H＋－ATPase活性、H＋－泵活性。

1.4 抑制剂VA预处理后美人蕉吸收硝酸盐效率的测定

美人蕉对硝态氮的吸收效率的测定参照1.2.2。

1.5 抑制剂VA预处理后美人蕉根部质膜H＋－ATPase活性的测定

农田废水处理（CK）和钒酸盐（VA）处理24h后收集美人蕉的根部，每份样品0.5g，液氮冷冻后置于－80℃冰箱保存备用，质膜的分离与纯化采用Miller等［4］的方法，略有改动。

1.6 抑制剂VA预处理后美人蕉根部质膜氢泵活性的测定

美人蕉根部氢泵活性的测定参照吖啶橙 （AO）A492处吸光值淬灭的方法［5］进行，略有改动。

1.7 数据处理

生理生化指标分析至少设置3次重复，用Excel统计学方法计算每组数据的平均值和相对误差，用DPS数据系统对所得数据进行显著性差异分析（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 农田废水成分分析

经测定杞麓湖农田废水水样pH为7.30，农田废水中NO3－的浓度为4.79 mg／L，约为《GB3838－2002》Ⅰ类水总氮上限值（TN：0.2mg／L）的24倍，农田废水PO43－的浓度为0.876mg／L，而《GB3838－2002》Ⅰ类水中总磷（TP）限值为0.02mg／L，农田废水中正磷酸根的浓度约为Ⅰ类水标准的44倍。由此可见，农田废水中N、P的浓度较高，过量使用化肥污染相当严重，是杞麓湖湖水污染的主要污染源。

向农田废水中添加适量的硝酸钾，使得农田废水中硝态氮的含量分别为9.58mg／L、14.37mg／L、18.27 mg／L，分别用三种不同硝态氮浓度的农田废水处理美人蕉并测定美人蕉对农田废水中硝态氮的吸收效率。实验表明美人蕉在一天内对硝态氮浓度为9.58mg／L的农田废水吸收效果最好，因此本研究选用硝态氮浓度为9.58mg／L的农田废水用于后续实验。

2.2 VA的应用对美人蕉植株吸收硝酸盐效率的影响

从图1可看出，随着VA预处理（VA）和农田废水 （CK）处理时间的延长，农田废水的硝态氮浓度均呈现逐渐降低的趋势。其中，对照组（CK）在前6h农田废水中硝态氮的浓度下降得最为迅速，由最初的9.58 mg／L下降到5.26 mg／L，对硝态氮的吸收率为45.1%；在继续处理的6～24h，美人蕉对硝态氮的吸收效率同样呈明显下降趋势，在处理24h后，农田废水硝态氮的浓度由最初的9.58 mg／L下降到1.69 mg／L，吸收率为82.4%。在VA预处理组中（VA），在处理6h后，农田废水中硝态氮的浓度由最初的9.58 mg／L下降到7.02 mg／L，对硝态氮的吸收效率为26.7%；在处理24h后，农田废水硝态氮的浓度由最初的9.58 mg／L下降到3.12 mg／L，对硝态氮的吸收效率为67.4%。随着VA和CK处理时间的延长，农田废水中的硝态氮浓度都呈下降趋势，在处理24h后，CK中美人蕉对硝态氮的吸收率为82.4%，VA中美人蕉对硝态氮的吸收率为67.4%，并且每个取样点VA处理农田废水中剩余硝态氮的浓度都显著高于CK。说明VA预处理后，降低了美人蕉对农田废水硝态氮的吸收效率。

2.3 VA预处理对美人蕉质膜H＋－ATPase活性和氢泵活性的影响

研究结果表明，美人蕉经VA预处理后，对农田废水中硝态氮的吸收效率下降，为了进一步了解美人蕉经VA预处理后，吸收废水中硝态氮效率下降是否与根部质膜H＋－ATPase活性的变化有关，本研究检测VA预处理和农田废水处理美人蕉后，其根中质膜H＋－ATPase的活性。图2A显示，随着农田废水处理时间的延长，CK和VA美人蕉根部质膜H＋－ATPase的活性都逐渐增加，处理不同时间点的值都高于处理前，并且经VA预处理的值始终低于同时间点的对照 （CK）。在农田废水处理之前（0h），对照组（CK）和VA预处理后，美人蕉根部质膜H＋－ATPase的活性分别为1.36和1.15μmol／mg·min，CK中质膜H＋－ATPase的活性是VA的1.18倍，表明在VA预处理后，美人蕉根部质膜H＋－ATPase的活性在一定程度表现出下降趋势。农田废水处理24h后，美人蕉根部质膜H＋－ATPase活性CK和VA分别上升到2.31和 1.91μmol／mg·min，比放入农田废水处理前（0h），其H＋－ATPase活性分别显著提高69.8%和66%，即经VA处理后，质膜H＋－ATPase的活性随处理时间的延长也有所上升，但上升的趋势较CK小。可见美人蕉在农田废水中处理24h后，根部质膜H＋－ATPase活性得到了明显的提高，但VA预处理后，却抑制H＋－ATPase活性的提高。

图2B结果表明，美人蕉经VA处理和CK处理后根部H＋－泵活性的变化趋势表现出与H＋－ATPase相似的情况。在农田废水未处理之前（0h），经VA预处理后美人蕉根部H＋－泵活性比CK低，大约低19%，说明VA的预处理之后，同样降低了美人蕉根部H＋－泵活性。在农田废水处理的过程中，VA和CK美人蕉根部H＋－泵的活性都表现出上升趋势，在农田废水处理24h时，VA的H＋－泵活性为处理前（0h）的1.61倍，CK的H＋－泵活性为处理前（0h）的1.75倍，同时还发现在农田废水处理的整个过程中，VA美人蕉根中H＋－泵的活性都要低于CK，在处理24h后，VA美人蕉根中H＋－泵的活性约占CK的74%。说明经过VA预处理后，美人蕉根部质膜氢泵的活性被明显降低。

3 结论

植物根系对硝态氮的吸收和同化是一个非常复杂的过程，多种酶协同参与其反应过程。在硝态氮的吸收阶段，目前公认的NO3－跨膜运输方式［6］是依靠细胞膜H＋－ATPase提供能量的H＋／NO3－共运输方式。质膜是细胞与细胞间质之间的一道通透性保护屏障，而定位于质膜上的质膜H＋－ATPase则是产生跨膜转运动力的主体。植物根系吸收的硝态氮进入植物体后，在不同类型的硝态氮转运蛋白的作用下，被运输到植物的不同组织，在植物的不同部位发生一系列的反应从而被植物同化，以供植物吸收和利用，而多余的硝态氮则储存在细胞液泡内。

在农田废水处理下，美人蕉根部与氮素吸收相关的质膜H＋－ATPase和H＋－泵活性随处理时间的延长而升高，说明农田废水处理可以提高质膜H＋－ATPase和H＋－泵活性；同时随着农田废水处理时间的延长，美人蕉根部对硝态氮的吸收效率增加，可见美人蕉在吸收硝态氮方面发挥着重要作用，是人工湿地系统中常见植物之一。

VA是质膜H＋－ATPase的特异抑制剂，通过VA处理美人蕉发现质膜H＋－ATPase和H＋－泵活性随VA的处理而降低，硝态氮吸收效率也相应降低。

［1］Di T J（狄廷均），Zhu Y Y（朱毅勇），Chou M H（仇美华），et al.Response of plasma membrane H＋－ATPase of rice root to ammonium and nitratenutrition［J］.Chinese Journal of Rice Science（中国水稻科学），2007，21（4）：360－366.

［2］Grace JB，Wetzel R G.Habitat partitioning and competitive displacement in cattails（Typha）：experimental field studies［J］. American Naturalist，1981（118）：463－474.

［3］本书编委会.水和废水监测分析方法：第四版 ［M］.北京：中国环境科学出版社，2002：246－248，259－261.

［4］Miller G，Suzuki N，Ciftci－yilmaz S，et al.Reactive oxygen species homoestasis and signaling during and salinity stresses［J］. Plant Cell Environ，2010（33）：453-67.

［5］Apel K，Hirt H.Reactive oxygen species：metabolism，oxidative stress，and signal transduction［J］.Annual Review of Plant Biology，2004（55）：373－399.

［6］Ottova V，Balcarova J，Vymazal.Microbial characteristics of constructed wetlands［J］.Water Science and Technology，1997，35（5）：117－123.

Im pact of Pretreating Canna by Vanadate on Absorption Efficiency of Nitrate Nitrogen in Farm land W astewater

WU Kong－huan1，WUWen－wei1，LIU Ang2，CHEN Li－mei2，LIKun－zhi2
（1.Yunnan Key Laboratory of Pollution Process and Management of Plateau Lake－Watershed（Prepare to Construct），Yunnan Institute of Environmental Science，Kunming Yunnan 650034，China）

Canna chosen as the target experimentalmaterial was pretreated using plasmamembrane H＋－ATPase activity inhibitor VA in order to investigate the influence of plasmamembrane H＋－ATPase activity in the canna roots on nitrate absorption efficiency.The results showed that the nitrate absorption efficiency dropped dramatically while adding 100 M VA.Meanwhile，the activities of plasmamembrane H＋－ATPase and H＋－pump were also significantly reduced.

farmland wastewater treatment；canna；vanadate pretreatment；nitrate；impact of

X52

：A

：1673－9655（2015）06－0039－04

2015－04－28