陈 鹏,张凡喜,周玉峰,张 波

(1.解放军第324医院神经外科,重庆 400020；2.第三军医大学大坪医院野战外科研究所,重庆 400042)

·论著·

FGFR2功能增强对软骨内成骨作用的机制研究*

陈 鹏1,张凡喜1,周玉峰1,张 波2△

(1.解放军第324医院神经外科,重庆 400020；2.第三军医大学大坪医院野战外科研究所,重庆 400042)

目的 利用模拟人Apert综合征的FGFR2S252W/+小鼠模型，研究ERK信号通路在成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)功能持续增强对软骨内成骨过程的影响。方法 动物繁殖、鉴定后分为FGFR2功能获得突变型和同窝野生型。于出生后6周获取骨髓间充质干细胞(BMSCs)进行体外培养及2代BMSCs成软骨诱导，对ERK信号蛋白检测，并比较Col2、Col10、OC、OP基因的表达。加入ERK信号通路阻滞剂PD98059后再次培养观察相应基因的表达。胚胎骨体外培养技术比较ERK信号通路在FGFR2功能持续增强对软骨内成骨过程的影响。结果 在体外BMSCs成软骨诱导后观察发现，FGFR2功能突变小鼠BMSCs表达总ERK蛋白量无明显变化，但磷酸化增强。FGFR2S252W/+小鼠BMSCs表达Col2、Col10较野生型弱，但OC、OP基因强于野生型小鼠。加入ERK信号通路阻滞剂PD98059培养后，对Col2、Col10基因影响不大，但OC、OP表达量增高。并且在胚胎骨体外培养过程中，发现PD98059治疗组能纠正FGFR2功能持续增强所致软骨内成骨发育障碍。结论 ERK信号通路是FGFR2下游影响软骨内成骨的关键通路，特别对软骨内成骨后期成骨过程影响巨大。其信号通路阻滞剂对软骨内成骨发育障碍有一定救治作用。

成纤维细胞生长因子受体2；ERK信号通路；骨髓间充质干细胞；软骨内成骨；软骨分化

利用基因敲入(knock in)技术构建模拟人Apert综合征的FGFR2S252W/+小鼠模型，Apert综合征由成纤维细胞生长因子受体2(fibroblast growth factor receptor2,FGFR2)的功能增强型点突变引起，患者表现冠状缝早闭、体形弱小、四肢短小畸形和指/趾畸形[1]。FGFR2功能增强对膜内成骨及软骨内成骨过程均有影响[2-4]，在对软骨内成骨过程中，FGFR2可能是通过下游MAPK通路进行调控，本研究主要探讨ERK信号通路在FGFR2功能持续增强对软骨内成骨过程的影响。

1 材料与方法

1.1 动物来源 本实验模型小鼠由美国国立卫生研究院(NIH)引入[5]，分别将雄性带neo基因+突变FGFR2的基因工程小鼠、雄性EII-Cre小鼠与雌性C57BL/6J小鼠(2～4月龄)交配扩增，得到的F1代经鉴定带neo基因+突变FGFR2的基因小鼠和EII-Cre小鼠再次交配，EII-Cre启动子去掉FGFR2-neo-S252W的neo基因，在子代中获得约1/4数量的FGFR2S252W/+功能获得性突变小鼠。小鼠基因型鉴定分为野生和突变(FGFR2S252W/+)两组。EII-Cre、C57BL/6J小鼠由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心提供。所有小鼠均为SPF级，在实验过程中由第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心饲养。

1.2 主要试剂与仪器 台式高速冷冻离心机(Sigma公司,德国)，电泳仪(Bio-Rad公司,美国)，PCR System 7500(Applied Biosy Stems公司,美国)，PCR仪(香港Gene Amp公司)，凝胶成像系统(Bio-Rad公司,美国)，超净工作台(成都新光生物净化工程研究所)，细胞培养箱(Thermo Forma公司,美国)，显微镜(Olympus公司,日本)，Spot内置彩色数码相机(Diagnostic Ins truments公司,美国)。主要试剂：蛋白酶K(Roche公司,美国)，地塞米松、TGF-β(Peprotech公司,美国)，ITS(Sigma公司,美国)，Rever Tre Ace-a-逆转录试剂盒(TOYOBO公司,日本)，Trizol(Gibco公司,美国)，Phospho-ERK/ERK抗体(Cell signal technology公司,美国)，ERK阻滞剂PD98059(Selleck公司,美国)，高糖DMEM、低糖DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶(HyClone公司,美国)，PBS液。

1.3 FGFR2S252W/+小鼠基因型的鉴定[6]小鼠剪取手指/脚趾，用含100 mg/L蛋白酶K的组织裂解液56 ℃裂解12 h，提取基因组DNA。用以下引物进行扩增：带neo基因+突变FGFR2小鼠，R2-7R2:5′-TTG ATC CAC TGG ATG TGG GGC-3′,RINA:5′-CCA GAC TGC CTT GGG AAA AGC-3′；EII-Cre小鼠，C1:5′-GCC TGC ATT ACC GGT CGA TGC-3′,C2:5′-CAG GGT GTT ATA AGC AAT CCC-3′；FGFR2S252W/+小鼠，R2I6F1:5′-TAG GTA GTC CAT AAC TCG G-3′,R2-7R2:5′-TTG ATC CAC TGG ATG TGG GGC-3′。PCR产物凝胶电泳后，根据条带对小鼠进行区分(图1)。

图1 小鼠基因型鉴定电泳图

1.4 骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)制备 将6周龄野生型及突变型小鼠脱臼处死后置于75%乙醇浸泡10 min，无菌条件下分离出胫骨、股骨；用剪刀剪去股骨、胫骨两端，用一次性注射器抽取含有10% 胎牛血清的DMEM(低糖)培养液反复冲洗骨髓腔，将骨髓细胞冲入无菌培养皿中；混匀吹散制成细胞悬液后，将细胞置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。24 h后细胞首次换液，以后每2 d换1次，7～8 d后细胞约90%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化4 min后吹打，脱落细胞以1 000 r/min离心5 min，按1∶2比例传代培养。选取生长良好的第2代细胞进行实验。

1.5 BMSCs成软骨诱导分化及信号阻断剂培养 取生长状态良好的第2代BMSCs，以5×105/孔接种于6孔板中，用含10% 胎牛血清的DMEM低糖培养基培养细胞。生长7 d左右，待细胞生长完全融合，换用成软骨诱导培养液[含有10%胎牛血清、10 ng/mL转化生长因子(transforming growth factor,TGF-β)、50 μg/mL抗坏血酸、10-7mol/L地塞米松、50 mg/mL胰岛素铁硒传递蛋白(insulin-transferrin-selenium,ITS)]的DMEM高糖培养基进行成骨诱导，每3 d换液1次。为了解ERK信号通路在软骨内成骨过程中的作用，在软骨诱导液基础上加入ERK信号通路阻滞剂PD98059，浓度20 μmol，进行培养。

1.6 实时荧光定量PCR检测基因表达 取成软骨诱导培养14 d细胞，加入1 mL Trizol提取RNA。紫外分光光度计测定纯度及浓度。取总RNA 1 μg，采用逆转录试剂盒进行逆转录反应，逆转录的cDNA置-20 ℃保存。小鼠的引物序列如下，Col2，sense primer,5′-TCT TTG GCT CAC TGG ACT CT-3′,antisense primer,5′-CCC CTC CTG CTG TGA AGT TG-3′；Col10,sense primer,5′-GCA GCA TTA CGA CCC AAG AT-3′,antisense primer,5′-CAT GAT TGC ACT CCC TGA AG-3′；OC,sense primer,5′-TCT GAC AAA GCC TTC ATG TCC-3′,antisense primer,5′-AAA TAG TGA TAC CGT AGA TGC G-3′；OP,sense primer,5′-TGC ACC CAG ATC CTA TAG CC-3′,antisense primer,5′-TGT GGT CAT GGC TTT CAT TG-3′。以cDNA为模板，进行PCR扩增，每次做3个复孔，每个基因重复3次。扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，45个循环。加完样后上实时荧光定量PCR仪反应。

1.7 Western blot检测 取2代BMSCs，提取总蛋白，制备5%浓缩胶和10%分离胶。每个孔上样10 μg蛋白样品，进行电泳。电泳结束后转膜，8%脱脂奶粉振荡封闭2 h。按一抗说明书进行稀释、孵育过夜。进行二抗室温孵育，PVDF条带浸入ECL化学发光液发光5 min后暗室进行曝光、显影。

1.8 胚胎长骨的体外培养 无菌条件下取胚胎(E16)小鼠胫骨进行消化10 min(1 mg/mL dispase溶液)，然后在解剖显微镜下进行操作，剥离绝大部分软骨外膜和骨外膜。标本置于滤纸上后放在不锈钢网上面，浸入BGJb培养基的井形培养皿的(BGJb培养基含0.2%牛血清清蛋白、50 μg/mL维生素C、10 mM β-甘油磷酸钠、2 mmol谷氨酸、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素)。置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度孵箱内孵育。每组各10个标本，分为3组。即野生型组(加入0.1%DMSO)、突变型组(加入0.1%DMSO)、PD98059治疗组(突变型组加入50 μmol PD98059)，每2 d换液。体外培养7 d后收集标本并固定，在解剖显微镜下测量标本总长度(total length，TL)，钙化组织长度(ossified tissue length，OL)。采用长度增加百分率来表示长度的变化。长度增加百分率=(体外培养7 d的长度-体外培养0 d的长度)÷体外培养0 d的长度×100%。

2 结果

2.1 FGFR2S252W/+小鼠BMSCs增强ERK信号通路磷酸化程度 对野生及突变FGFR2S252W/+小鼠BMSCs中ERK总蛋白及其磷酸化水平利用Western blot技术进行检测。结果显示突变型FGFR2功能增强点突变后BMSCs中ERK总蛋白量表达差异无统计学意义，而磷酸化水平表达增强(图2)。结果揭示BMSCs软骨内成骨过程中FGFR2可能经过ERK信号通路对其调控。

2.2 PD98059使BMSCs中ERK信号通路磷酸化程度减弱 在BMSCs成软骨诱导液中加入ERK信号通路阻滞剂PD98059，探索ERK信号通路在FGFR2介导BMSCs软骨内成骨分化的调控作用。再次运用Western blot技术发现，PD98059抑制ERK磷酸化水平，说明抑制ERK信号通路，见图2。

图2 Western blot显示FGFR2S252W/+BMSCs中信号通路变化

2.3 使用PD98059后对BMSCs表达基因的影响 利用定量PCR方法分别检测BMSCs成软骨诱导21 d后成软骨、成骨分化基因表达。作者发现表达成软骨分化基因Col2、Col10突变型小鼠BMSCs表达量低于野生型小鼠(P<0.05)，而反应软骨内成骨晚期成骨分化基因OC、OP提示突变型小鼠BMSCs表达量高于野生型小鼠(P<0.05)。这些结果显示FGFR2功能增强对BMSCs软骨内成骨分化过程中早期成软骨分化是抑制作用，而晚期成骨分化是促进作用(图3)。将BMSCs在加入ERK阻断剂成软骨诱导培养后，检测21 d后相关基因的表达变化，发现PD98059培养后对BMSCs表达Col2、Col10变化不大，对表达成骨分化OC、OP基因有所增强(图3)。

*：P<0.05，与control组BMSCs比较；#：P<0.05，与WT组BMSCs比较。

图3 通路阻滞剂培养对成软骨、成骨基因表达的影响

2.4 体外培养长骨的生长情况 取材胚胎小鼠的胫骨(E16)在体外培养条件下继续生长发育。体外培养7 d观察，野生型及突变型小鼠胫骨的TL及OL有明显差异，突变型小鼠骨发育落后于野生组小鼠，TL、OL均短于野生型小鼠，说明FGFR2增强在体外培养过程中也抑制软骨内成骨过程。而添加PD98059后体外培养突变型小鼠长骨TL及OL明显增长，较突变型小鼠有明显差异，说明ERK信号通路阻滞剂PD98059可能对由FGFR2持续增强介导的软骨内成骨迟缓有救治作用(图4)。

*：P<0.05，与MT组比较；#：P<0.05，与WT组比较。

图4 胚胎骨体外培养观察及长度增长比例比较

3 讨论

FGFRs属于受体酪氨酸蛋白激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)家族，主要有4种受体(FGFR1、2、3、4)，他们通过与成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGFs)结合发挥生物学功能。遗传学研究发现部分人类遗传骨骼疾病由FGFR突变引起，说明FGFR对骨骼的生长发育起着非常重要作用[1,6-8]。

利用基因敲入技术建立了FGFR2功能获得性基因突变小鼠模型，其FGFR2功能持续增强，除了表现颅缝早闭、圆颅畸形外，突变小鼠出现体形弱小、四肢的短缩畸形，这些临床表现符合Apert综合征患者临床表现[9-10]。既往研究发现在骨骼发育过程中，FGFR2不仅调节成骨细胞的发育，在软骨细胞同样检测到FGFR2[2,11]，说明FGFR2还能够调节软骨细胞发育，影响软骨内过程。

BMSCs具有取材方便、更新能力强、有多向分化能力等优点受到广泛关注。而在软骨内成骨过程中，正是由骨髓间充质干细胞密集开始，逐渐分化形成软骨细胞及软骨样骨胚，随着破骨细胞侵入、吞噬及其血管延伸形成，软骨细胞被成骨细胞取代，钙化成骨。本实验获得FGFR2功能持续增强的骨髓间充质干细胞进行研究，体外模拟软骨内成骨过程，主要研究下游关键信号通路对FGFR2介导软骨内成骨的影响。

既往研究证实在骨骼发育过程中FGFs/FGFRs信号发挥非常重要的作用，而MAPK作为FGFs/FGFRs信号下游通路在骨骼发育过程中作用重大，MAPK通路主要由ERK、JNK、p38共3种激酶组成，研究表明ERK信号通路在成骨细胞和软骨细胞的发育中扮演重要角色[12-14]。本研究发现FGFR2S252W/+突变BMSCs的ERK磷酸化程度显著增强，这个结果提示FGFR2通过调控下游ERK通路对软骨内成骨进行调节。为进一步验证结果，继续通过ERK信号通路阻断实验证实在体外诱导培养的BMSCs中添加ERK通路的阻断剂PD98059，可见显著缓解了ERK磷酸化的表达。体外诱导培养BMSCs模拟软骨内成骨过程，进一步运用实时荧光定量PCR比较通路改变后对成软骨、成骨分化基因的改变。研究发现突变型BMSCs联合ERK通路阻滞剂联合培养后，成软骨基因Col2、Col10变化不大，而成骨相关基因OC、OP表达有上调。结合软骨内成骨过程，作者考虑FGFR2受体通过下游ERK信号通路在早期成软骨过程中ERK通路作用影响不大，而在后期成骨过程中通过ERK通路负性调节成骨发育过程，最终阻碍软骨成骨过程。既往Miraoui等[12]研究发现在FGFR2功能增强的间充质干细胞C3H10T1/2中ERK1/2及PKC通路激活调控成骨增殖、分化过程，对成脂过程影响不大。

作者取胎鼠(E16d)胫骨构建体外培养模型，进一步验证在软骨内成骨过程中FGFR2S252W/+模型中ERK通路的影响。体外培养模拟长骨发育过程，实验发现在胚胎发育期间FGFR2S252W/+小鼠其长骨总长度及钙化长度均短于野生型小鼠，说明FGFR2功能增强导致突变型小鼠软骨内成骨较同窝野生型小鼠迟缓。而经体外运用ERK信号通路的阻断剂PD98059(浓度50μmol)联合培养后，突变型小鼠长骨发育障碍得到一定纠正，同之前Yin等[2]报道在FGFR2S253W/+模型中体外培养颅骨、长骨中加入PD98059延缓颅缝早闭及纠正长骨发育障碍基本一致。本实验证实FGFR2增强影响下游ERK通路对软骨内成骨过程进行调控，运用ERK信号阻滞剂对突变型小鼠软骨内成骨发育迟缓有一定救治作用。

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The study of the mechanism in the endochondral ossification of bone mesenchymal stem cells in mice by continued enhanced function of fibroblast growth factor type Ⅱ receptor mutation*

ChenPeng1,ZhangFanxi1，ZhouYufeng1，ZhangBo2△

(1.DepartmentofNeurosurgery，PLAHospital324，Chongqing400020,China;2.ResearchInstituteofSurgery,DapingHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400042,China)

Objective To study the role of ERK signal pathway in the endochondral ossification of bone mesenchymal stem cells,and to explore the mechanism of ERK signal pathway in persistent enhanced FGFR2 function on development of mice BMSCs by a knock-in mouse model with the FGFR2S252W/+.Methods Mice with neo-FGFR2 gain-of-function mutation were mated with EII-Cre mice.The genotype of generation mice were identified by PCR and divided into wild type group and mutant type group according to their genotype.6 week-old mice were sacrificed to receive bone mesenchymal stem cells.The western blot was used to compare the level of P-ERK and ERK and the RT-PCR was applied to detect the genes of Col2,Col10,OC,OP in chondrogenic differentiation medium of BMSCs.Then,treatment of cultured BMSCs with PD98059,compare the changes of genes and utilize the in vitro culture of long bones detect the role of ERK signal pathway in the endochondral ossification by FGFR2 mutant.Results We successfully derive BMSCs from FGFR2S252W/+mutant mice and found the activity of ERK signal pathway of FGFR2S252W/+was enhanced.After been cultured in chondrogenic differentiation medium,the expressions of the BMSCs mRNA of Col2,Col10 from mutant group were decreased,while the expressions of OC,OP were increased.Those OC,OP genes levels showed an increased treated by PD98059.Using in vitro culture of long bones,we found the retardation of total length growth of long bones has been rescued by PD98059 treatment,suggesting that ERK signal pathways was responsible for the retarded long bone development in FGFRS252W/+mice.Conclusion The results indicate these effects are mediated by the ERK signal pathway.Furthermore,the retardation of long bones has been recued by PD98059 treatment,suggesting that ERK signal pathway is responsible for the retarded long bone development in FGFR2S252W/+mice.

FGFR2;ERK signal pathway;bone mesenchymal stem cells;endochondral ossification;chondrogenic differentiation

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.08.001

国家973计划重点基础研究发展计划基金资助项目(2011CB964701)。 作者简介：陈鹏(1983-),医师，硕士，主要从事临床神经外科研究。△

，Tel：13527371337；E-mail：zhangbo67184@163.com。

R336

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1671-8348(2015)08-1009-03

2014-10-08

2014-12-10)