马华威　杨会成　吴一桂　金煜华

摘 要：采用胃蛋白酶从鮟鱇鱼皮中提取胶原蛋白，分析胃蛋白酶酶溶性胶原蛋白的氨基酸组成和超微结构，并研究体内外清除自由基机理。结果表明：胃蛋白酶酶溶性胶原蛋白的超微结构呈均匀网状分布，是良好的药物载体，体外清除自由基效果呈质量浓度依赖性，当质量浓度为10 mg/L时，清除超氧阴离子自由基（O2-·）和羟自由基（·OH）能力最强。体内实验显示其能显著抑制小鼠皮肤中丙二醛生成，提高超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和羟脯氨酸含量，当剂量为100 mg/（kg·d）时最好。提示该胶原蛋白具有体内外清除自由基作用，其氨基酸组成、超微结构与清除自由基能力有关，提取的鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白清除自由基活力接近于提取的胶原蛋白肽。

关键词：鮟鱇鱼；胃蛋白酶溶性胶原蛋白；自由基；清除作用

Abstract： The amino acid composition， ultrastructure and in vitro free radical scavenging activity and in vivo antioxidant activity of pepsin soluble collagen from Lophius litulon skin were investigated. The results showed that the pepsin soluble collagen could potentially be a good drug carrier due to its well-distributed network ultrastructure. The collagen exhibited scavenging activities against superoxide anion and hydroxyl free radicals in a dosage-dependent manner， reaching the highest activity at a concentration of 10 mg/L. In vivo experiments indicated that the collagen remarkably inhibited the formation of malondialdehyde （MDA） and hydroxyproline （Hyp） and the activities of superoxide dismutase （SOD）， catalase （CAT）， glutathione peroxidase （GSH-Px） in mouse skin homogenate and the strongest inhibitory effect was observed at

100 mg/ （kg·d）. These findings imply that the pepsin soluble collagen has free radical scavenging activity both in vitro and in vivo comparable to that of the peptides derived from Lophius litulon skin collagen obtained in our previous study， which is associated with its amino acid composition and ultrastructure.

Key words： Lophius litulon； pepsin soluble collagen； free radical； scavenging effect

中图分类号：Q936.16 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2015）09-0011-05

目前，公众越来越重视减缓皮肤老化和改善皮肤状况。氧自由基被认为是导致皮肤老化的主要物质，主要是低价还原分子氧产生的活性氧（reactive oxygen species，ROS），如超氧阴离子、过氧化氢、单线态氧。有报道称，给ICR小鼠注射D-半乳糖8 周后能产生皮肤衰老[1-3]。D-半乳糖主要诱导ROS损伤由超氧化物歧酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）等抗氧化酶、亲油基清除剂生育酚（tocopherol，VE）和亲水基清除剂谷胱甘肽（glutathione，GSH）构成的皮肤细胞内源性防御系统[4-5]。另外，D-半乳糖导致皮肤老化与皮肤中羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）含量减少和丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量增加有关[6]。D-半乳糖能使皮肤中Hyp含量减少、MDA生成量增加及SOD、CAT和GSH-Px活性受到抑制，造成皮肤细胞氧化损伤，最终导致色素累积，以及皮肤内部结构联结、增厚，胶原纤维降解和弹性损伤，产生皱纹和皮肤老化[7]。有报道称，从鱼骨、鱼皮中提取的胶原蛋白和明胶能抑制D-半乳糖诱导的小鼠皮肤衰老[8]。本课题组之前对鮟鱇鱼皮制备胶原蛋白肽及体内外清除自由基活性进行了报道[9-12]，也有研究者对鮟鱇鱼皮制备胶原蛋白工艺报道[13-15]。但对鮟鱇鱼皮胃蛋白酶溶性胶原蛋白（pepsin soluble collagen，PSC）清除自由基机理研究鲜少。

本实验采用胃蛋白酶从鮟鱇鱼皮中提取酶溶性胶原蛋白，对该胶原蛋白的氨基酸组成和超微结构进行分析，初步探讨其体内外自由基清除机理，并与本课题组之前提取的鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽清除自由基活性进行对比，以寻找出既在经济上节约又有较好活性的物质。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鮟鱇鱼皮由浙江海力生集团有限公司提供，70 ℃冷冻保存，实验时4 ℃解冻。昆明种小白鼠由浙江大学实验动物中心提供，体质量23～25 g，雌雄各半，实验动物合格证号SCXK（浙）20030001。

小牛皮肤胶原蛋白（calf skin collagen，CSC）

美国Sigma公司；胃蛋白酶（750 U/mg） 南宁庞博生物工程有限公司；Tris-HCl、发光氨、1，10-邻二氮菲、邻苯三酚、三氟乙酸 国药集团化学试剂有限公司；CAT、SOD、GSH-Px、MDA试剂盒 南京建成生物工程有限公司。以上试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1800PC光度计、WDD-2型电脑发光测试仪 生工生物工程上海（股份）有限公司；HITACHI 835-50氨基

酸分析仪、Micct-Q型超纯水器、TM-100扫描电子显微镜 日本日立公司；JEOL JFC-1200精细镀膜仪 西安景润电子科技有限公司；DN-08C定氮仪、HH-4数显恒温水

浴锅 上海尤尼珂仪器有限公司；透析袋 北京索莱宝科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白提取[1]

所有步骤均在4 ℃条件下进行操作。剔除残肉，去除非胶原蛋白残余物，利用0.1 mol/L NaOH溶液抑制内源性蛋白酶水解胶原蛋白，然后剪成4 cm×4 cm碎片，匀浆机破碎。依照料液比1∶15（m/V）溶于0.5 mol/L乙酸溶液，以20 U/g添加胃蛋白酶，不断搅拌，48 h后三氟乙酸灭酶，双层棉布过滤。剩余鱼皮匀浆物在同等条件下重提过滤后，合并两滤液，添加NaCl盐析沉淀，离心获得沉淀物。取上清液再次用NaCl沉淀离心，合并沉淀物。0.5 mol/L乙酸溶解沉淀物后，用5 000 D透析袋0.1 mol/L乙酸透析24 h，随后蒸馏水透析12 h，渗析液冷冻干燥后即得鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白。参考美国分析化学家协会（Association of Official Analytical Chemists，AOAC）蛋白、水分、灰分和脂肪评价方法[16]，分别测定新鲜鮟鱇鱼皮、鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白的蛋白、水分、灰分和脂肪含量。计算蛋白含量以转换系数6.25为基准，通过相似性分析评价胃蛋白酶提取效果。

1.3.2 鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白氨基酸组成分析

氨基酸分析前，胶原蛋白样品先在120 ℃条件下用6 mol/L HCl 密封水解6 h，水解物经蒸发后溶于30 mL柠檬酸缓冲液，然后取0.06 mL样品用于氨基酸自动分析，以CSC作为对照。

1.3.3 鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白·OH清除率测定[10]

分别取2.0 mL样品液和1.0 mL 1.865 mmol/L 1，10-邻二氮菲溶液加入密封真空管，混合均匀。吸管吸取1.865 mmol/L FeSO4·7H2O溶液1.0 mL添加入混合液中。以3∶13（V/V）的比率每次添加1.0 mL H2O2 进行反应。水浴锅中37 ℃孵育1 h后，以H2O2为空白对照，在536 nm波长处测定吸光度。以不含有抗氧化物反应混合液为阴性对照。按公式（1）计算胶原蛋白·OH清除率。

1.3.4 鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白O2-·清除率测定[10]

分别取0.1 mL样品液、850 ?L 1 mmol/L发光氨、50 ?L新配制的0.625 mmol/L邻苯三酚在真空管中混合反应。发光仪测定体系中的发光氨，以磷酸盐缓冲液（50 mmol/L，pH 7.8）作为空白对照。按公式（2）计算胶原蛋白O2-·清除率。

1.3.5 鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白抗D-半乳糖诱导氧化活性的测定[10]

1.3.5.1 小鼠衰老模型建立及给药

根据雌雄各半和体质量将小鼠随机分成4 组，每组10 只：模型组、正常组以及剂量组（低剂量组、高剂量组）。注射1 000 mg/（kg·d）D-半乳糖给模型组、剂量组小鼠皮下。同时，低剂量组和高剂量组分别给鮟鱇鱼皮胶原蛋白50、100 mg/（kg·d），饲喂量2 mL，正常组和模型组每天给予2 mL生理盐水。在30 d实验中，所有的动物都允许水和标准饲料自由采食。

1.3.5.2 样品收集

停药次日取小鼠皮下组织，剪切成碎片后，4 ℃条件下用生理盐水以1∶9（m/V）均浆制备混合液。经3 000×g离心15 min后取上清液。上清液存储在20 ℃。

1.3.5.3 样品指标测定

依据试剂盒要求测定小鼠背部皮肤均浆液SOD、GSH-Px、CAT活性及MDA含量，依据比色法测定Hyp含量。

1.4 数据分析

除氨基酸组成分析数据外，所有实验数据均测量3 次，最终数据以±s表示，采用方差分析（analysis of variance，ANOVA）分析差异性。所有统计分析用Origin 7.0软件。

2 结果与分析

2.1 鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白产量及相似性分析

采用胃蛋白酶从鮟鱇鱼皮中提取的胶原蛋白产量约11.33%，由表1可知，该胶原蛋白的蛋白含量约82.65%，比新鲜鱼皮（25.11%）高，而脂质（2.63%）、灰分（7.18%）和水分（7.54%）均较低。约63.49%灰分和79.8%脂质从原材料鱼皮中被去除，表明在胃蛋白酶添加量20 U/g、pH 2.0、4 ℃条件下提取24 h，能有效地提取出鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白。

2.2 鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白氨基酸组成分析

由表2可知，鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白中Gly含量为344个氨基酸残基/1000，Hyp含量为83个氨基酸残

基/1000，低于对照蛋白。另外该胶原蛋白中Met、Hyl、Tyr、His含量较低，且Cys未检测出，Arg、Glu、Phe、Leu、Ile分别占总氨基酸的5.2%、10.1%、0.8%、1.2%、1.8%。

2.3 鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白超微结构

鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白低压冷冻后，超微结构呈均匀疏松式纤维多孔状结构，如图5所示。

2.4 鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白体外自由基清除作用

由图2可知，在2～10 mg/mL质量浓度范围，该胶原蛋白清除·OH和O2-·效果呈质量浓度依赖性，质量浓度为10 mg/mL时，对·OH和O2-·清除率分别是为70.16%和69.58%，均低于焦磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate，TPP）和丁基羟基茴香醚（butyl hydroxy anisol，BHA），但高于VC，即BHA>TPP>PSC>VC，其中当质量浓度为10 mg/mL清除自由基效果最强。

2.5 鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白体内清除自由基作用

鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白对小鼠背部皮肤生化活性影响，由表3可知，灌胃100 mg/（kg·d）剂量D-半乳糖后，经测试，小鼠皮肤组织的SOD、CAT、GSH-Px生化活性降低了16.2%、30.7%和31.3%，Hyp含量减少了30.5%，MAD含量增加了36.6%。与模型组比，低剂量组

（50 mg/（kg·d））（P<0.05）和高剂量组（100 mg/（kg·d））

（P<0.01）的SOD、GSH-Px、CAT活性水平显著提高、Hyp含量增加、MDA含量降低。与50 mg/（kg·d）剂量组相比，100 mg/（kg·d）剂量组活性最佳。

3 结 论

近些年，鮟鱇鱼成为世界重要经济渔种，通常在加工成鮟鱇鱼片或鱼丸制品后产生了大量不可食用鱼皮、鱼骨等副产物，往往被丢弃或作为低值饲料，不仅导致资源浪费也造成环境污染。据报道，鱼鳞、鱼皮、鱼骨等加工副产物中含有丰富的胶原蛋白，约占总蛋白30%[1]。与陆源动物胶原蛋白比，从海洋生物中提取胶原蛋白具有提取效率高、疾病传播低、污染少、无宗教障碍限制等特点[2]。本实验提取的鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白的产量高于西班牙鲭鱼皮胶原蛋白（3.49%）、大眼鲷鱼皮胶原蛋白（6.4%）和褐斑红鲷鱼皮胶原蛋白（9.0%）[17]。可能是物种、生物条件、组织组成和结构、提取环境和方法的不同造成种类间胶原蛋白产量的差别[18]。酶解能导致蛋白质的结构破坏，使活性氨基酸残基打开和暴露，通过还原自由基、螯合金属离子阻断脂质过氧化或去除特定氧化剂等方式清除自由基[19]。鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白具有体外清除自由基的效果，可能是胃蛋白酶在提取过程中作用鮟鱇鱼皮上的胶原蛋白分子，使活性氨基酸暴露，增大了与自由基分子反应的概率。蛋白质清除自由基作用与自身分子质量大小和氨基酸组成有关[19]，而鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白清除自由基活性接近本课题组之前提取的鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽，可推断两者清除自由基活性与分子质量关系不大或之前提取的肽不够纯。这些现象表明，对鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽纯化或多酶水解的进一步研究有重要意义。另外，与之前提取的鮟鱇鱼皮胶原蛋白肽相比，提取鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白不仅活性大小接近肽还节约了成本。

冷冻干燥是用于制备均匀多孔胶原蛋白的最有效手段。在软骨植入和再生、伤口愈合治疗过程中，胶原持水量、活性与孔径大小相关[13，17]。该胶原蛋白均一规则的超微结构似海绵，其清除自由基的活性可能与这一独有结构有关。另外，这一结构不仅有利于促进药物均匀分布，也利于液体蒸发，孔径可调，能够作为药物优质载体。

长期服用一定剂量的D-半乳糖使机体自由基和ROS增多，形成氧化应激，导致SOD、CAT、GSH-Px活性和Hyp含量下降及MDA含量增加，最终造成各种皮肤细胞损伤[11]。本实验发现，给予昆明种小鼠1 000 mg/kg剂量的D-半乳糖能使小鼠皮肤老化，该衰老模型实验结果符合Dae等[8]和本课题组之前的研究[10]，表明本实验所需小鼠皮肤衰老模型已成功构建。有报道称50、120、200、500、1 250 mg/kg剂量的D-半乳糖也能导致鼠皮肤老化[20]，可能是由于啮齿类动物体质量、年龄、营养状况不同，导致了形成皮肤衰老的D-半乳糖剂量不同。

CAT、SOD、GPH-Px在体内起到清除自由基的作用，主要是：CAT使体内的过氧化物转化成氧和水；SOD是抗氧化防御系统的守门员，催化O2-·转变成过氧化物；GSH-Px有效地催化谷胱甘肽（glutathione，GSH）清除过氧化物的反应[20]。这3 种物质在机体内的变化是考察物质清除自由基活性强弱的常用指标。灌胃鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白后，小鼠皮肤组织的SOD、CAT、GSH-Px活性显著提高，初步表明该胶原蛋白具有体内清除自由基作用。D-半乳糖诱导机体内GSH氧化和泄漏也是致皮肤老化的原因[2]。据报道，GSH含有强活泼的巯基（-SH），在细胞抗氧化防御系统中，作为重要自由基清除剂或辅助因子，当氧化应激发生时，游离的GSH能从还原型转变为氧化型，而在还原酶作用下又恢复还原型，阻止氧化反应进程[4]。与模型组比，灌胃鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白后，小鼠皮肤明显状况好转，可能是该物质提高了还原酶GSH-Px催化GSH清除过氧化物的活性。Hyp能稳定胶原3 螺旋结构，皮肤中Hyp含量减少，弱化了胶原3 螺旋结构，引起皮肤褶皱[4]，因此Hyp含量也可作为考察药物体内清除自由基能力的指标。该胶原蛋白的Hyp约占总氨基酸的8%，两个剂量组均能显著提高皮肤中Hyp的含量，说明该胶原蛋白通过补充Hyp量来改善皮肤外观。MDA含量是考察脂质过氧化的泛用指标，其多寡表示皮肤老化程度[19]。实验结果显示，服用2 种剂量的胶原蛋白后小鼠皮肤中MDA含量减少，说明鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白通过与MDA作用阻止皮肤脂质过氧化。

鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白Gly占氨基酸组成的34.4%，符合Gly是胶原蛋白主要氨基酸种类且占总氨基酸的33%以上的观点[17]。胶原蛋白清除自由基作用与自身氨基酸组成有关，受氨基酸残基种类、组成和序列影响，主要是Gly、Pro和疏水氨基酸承担自由基清除作用[21]，

而这些氨基酸在鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白中含量较高，该胶原蛋白良好的清除能力可归因于这一特有氨基酸组成。另外，由L-精氨酸、L-谷氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-丙氨酸按特定比率构成的模式，也能够有效地阻止皮肤老化[4]。鮟鱇鱼皮酶溶性胶原蛋白能起到阻止皮肤衰老的作用，可能自身也有这一独特的氨基酸模式。

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