张淑华 刘秋玲 吴志婷 王云霞 温明华 葛郁芝

(江西省人民医院 江西省心血管病研究所，江西 南昌 330006)

近年来发现，随着心肌缺血、损伤、坏死和重构，同一区域的心脏自主神经，尤其是交感神经也随之发生一定程度的损伤、坏死和重构〔1〕。对于心脏自主神经的损伤坏死，目前还没有找到有效的解决办法。近年，利用RNAi研究干细胞的增殖与分化已有一些报道。Zeng等〔2〕使用miR-100靶向BMPR2调节脂肪间充质干细胞(ADMSCs)成骨分化。Yang等〔3〕发现miR-138能够抑制 ADMSCs的脂肪分化。Uchida等〔4〕报道miR-9调控神经祖细胞的增殖与迁移。Doddapaneni等〔5〕过表达miR-122提高胎肝干细胞的肝细胞分化。为了探索人ADM-SCs(HADMSCs)向神经干细胞(NSCs)分化的高效率诱导方法，又鉴于本实验室有shR-377诱导骨髓间充质干细胞向造血干细胞诱定分化的研究基础，本文选择了shR-377联合细胞因子诱导HADMSCs向NSCs定向分化，以期提高HADMSCs向NSCs诱导分化的转化率，缩短转化时间，提高转化质量，为体外大量获得NSCs提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM/F12，DMEM(Hyclone公司);胎牛血清(PAA公司);阳离子脂质体lipofectamine2000及Opti-MEM(Invitrogen公司);胰酶、胶原酶、抗生素、DMSO(Gibco);成纤维母细胞生长因子(FGF)-b，表皮细胞生长因子(EGF)，胰岛样生长因子(IGF)-1，干细胞因子(SCF)均购自Miltenyi公司;骨形成蛋白(BMP)4购自invitrogen公司。shR-377载体(上海吉玛生物制药公司构建);细胞培养箱(THERMOFORMA);实时定量PCR仪(ABI公司);流式细胞分析仪(BD公司)。

1.2 方法

1.2.1 HADMSCs分离培养及鉴定 成人脂肪取自吸脂手术患者(中国医学科学院整形医院)，与供者签订知情同意书，供者均为25～35岁的健康女性。吸脂术采集的脂肪组织用PBS(含100 U/ml青霉素与100μg/ml链霉素)反复清洗，洗去血细胞和麻醉药，加入1∶1体积的0.2%Ⅰ型胶原酶37℃恒温水浴锅内振荡消化1 h，此时液面分为3层，上层为黄色油状脂肪细胞层，中层为脂肪组织层，下层为含单个核细胞的胶原酶层，100目滤网过滤至50 ml离心管，离心1 400 r/min×10 min后弃上清，用PBS洗2遍以除去胶原酶，离心收集细胞。分离出的单个细胞以2×106/ml的密度接种于 HADMSCs培养基中，37℃、5%CO2的培养箱培养。24 h首次换液，去除未贴壁细胞，以后每2～3 d换液一次。使用倒置显微镜观察生长情况，对连续传20代细胞的生长、增殖形态、有无分化进行观察、摄像。

1.2.2 HADMSCs的表型鉴定 胰酶消化HADMSCs并吹打为单个细胞，每个样本的细胞数量至少为1×106/ml，分别与CD29-PE、CD45-FITC、CD44-PE、CD117-FITC 标记的单克隆抗体室温避光孵育30 min，流式缓冲液洗涤3次，FACScalibur流式细胞仪检测。

1.2.3 shR-377联合细胞因子诱导HADMSCs向NSCs定向分化 将已经铺好的6孔板中培养基换成Opti-MEM培养基，shR-377用Opti-MEM稀释后，37℃孵育5 min加入6孔板，转染6 h后换成诱导培养基。并设定荧光标记shR-377的对照组，荧光显微镜下观察转染效率。实验分为空白对照组、单转shR-377组、单用细胞因子组，shR377+细胞因子组。转染前培养基均为HADMSCs培养基，单转shR-377组及shR377+细胞因子组转染shR377，其余两组未转染;第一次转染shR-377 8 h后，空白对照组、单转shR-377组加入HADMSCs培养基，另外两组加入诱导培养基A;第二次转染shR-377 8 h后，空白对照组、单转shR-377组仍加入HADMSCs培养基，另外两组加入诱导培养基B。

诱导培养基 A:FGF-b、BMP4、B27、activinA;诱导培养基 B:IGF-1、EGF、SCF、FGF-b，于 37℃、5%CO2继续培养。从次日起在倒置显微镜下对HADMSC向NSCs诱导过程的细胞形态变化进行观察、摄像。

1.2.4 流式细胞检测诱导后细胞nestin及转化率 0.25%胰蛋白酶消化诱导后第1日细胞，用PBS反复洗涤后计数，制成单细胞悬液，每个样本的细胞数量至少为1×106/ml，与nestin/FITC标记的单克隆抗体室温避光孵育30 min，流式缓冲液洗涤3次，流式细胞仪检测。按流式分析所得nestin的阳性率为诱导分化的转化率。

1.2.5 RT-qPCR检测诱导后细胞nestin和musashi表达 收集诱导后24 h细胞，提取总RNA，按照试剂说明书，后续RT-qPCR。反应参数:第一步:95.0℃，30 s;第二步:95.0℃，5 s;60.0℃，34 s;第 3 步:95.0℃，15 s;60.0℃，1 min;95.0℃，15 s。

PCR引物使用primer5.0软件设计，由上海生工生物工程有限公司合成，并经HPLC纯化。引物序列:GAPDH正义CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA，反义 TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC，长度598 bp;CD29正义 TCCAAGCAACCTGAGCAAC，反义 GATCTGAGTTCGCACCACTG，长度 238 bp;Nestin正义 AACAGCGACGGAGGTCTCTA，反义 TTCTCTTGTCCCGCAGACTT，长度220 bp;musashi正义 CCCACTACGAAACGCTCCAG，反义 TCGCAGATAACCCGCCTACA，长度193 bp。

1.2.6 免疫细胞化学检测诱导后细胞nestin 转染后第3日细胞，添加4%的多聚甲醛(用 PBS溶液稀释)，室温固定15 min，漂洗三次，每次10 min，加入0.5%的Triton X-100室温下浸泡10 min，37℃下用PBS溶液漂洗三次，每次10 min;用含1%BSA(牛血清白蛋白)的 PBS溶液(blocking buffer)封闭细胞，37℃下1.5 h(或者4℃过夜)。加带荧光的一抗anti-nestin/FITC(用1%BSA稀释)，4℃孵育2 h，荧光显微镜下观察。

1.3 统计学方法 采用SPSS13.0软件，计量资料用以x±s表示，多组间比较用单因素方差分析。

2 结果

2.1 HADMSCs形态学特征 倒置显微镜下观察，细胞接种时，培养物中混有部分红细胞，这些红细胞随换液次数的增多而被清除。培养的HADMSCs大部分于24 h内即贴壁，贴壁细胞呈圆形，有小的胞质突起。1 w后以梭形细胞为主，胞质丰富，核大，核染色质细，核仁明显，可见细胞呈克隆样生长。传代细胞在12～24 h内完全贴壁，并开始伸展、分裂。经首次传代以后，细胞生长速度增快，约3～4 d即可达80%融合。传代后细胞呈长梭形，呈纤维样细胞形态，细胞呈平行排列生长或漩涡状生长，核居中，多数为1个核仁，以一点为中心向四周放射状分布，圆形或卵圆形混杂生长细胞随传代次数减少。

2.2 HADMSCs细胞的表型鉴定 流式细胞仪测定了HADMSCs的表面标志 CD29、CD44、CD45和 CD117，其中 CD45和CD117为阴性。而CD29和CD44为阳性。

2.3 shR-377转染HADMSCs的转染效果 倒置荧光显微镜下观察，开启荧光的暗视野下约95%的细胞都有荧光(图1B)，与没有开启荧光的明视野(图1A)对比鲜明。说明转染率达到95%左右，可见所用的转染试剂和转染浓度是合适的。

图1 shR-377转染效果图(×100)

2.4 HADMSCs向NSCs定向分化的形态变化 诱导后第1、3、7日在倒置显微镜下观察、摄像:空白对照组(A)及单转shR-377组(B)细胞形态未见明显变化，只是细胞生长密度增大;单用细胞因子组(C)细胞形态未见明显变化，可见部分细胞粘连聚集，少数细胞由原来的菱形、三角形变成长条形;shR-377+细胞因子组(D1):细胞转染后第1天，细胞核见隆起;shR-377+细胞因子组(D3):转染后第3天，细胞伪足变细成单极、双极或多极，单极类似蝌蚪形，折光性增强;shR-377+细胞因子组(D7):转染后第7天，可见细胞聚集成细胞球，其余细胞也见聚集趋向。

图2 HADMSCs向NSCs定向分化的形态变化

2.5 RT-qPCR检测nestin和musashi的mRNA表达 空白对照组高表达CD29，几乎不表达nesti和 musashi;单转shR-377组较高表达CD29，低表达nestin和musashi;单用细胞因子组较高表达CD29，低表达nestin和musashi;shR-377+细胞因子组:中等表达CD29，高表达nestin和musashi。见图3。

图3 各组诱导后细胞的CD29、nestin、musashi表达水平

2.6 流式细胞仪检测诱导后细胞nestin及转化率 以HADMSCs为对照，诱导后NSCs的nestin阳性率为(64.6%±3.2%)，对照组为(0.6%±0.05%)。两组nestin阳性率比较有显著性差异(P＜0.01)。初步判断诱导后细胞是神经干细胞，其转化率为64.6%±3.2%。

2.7 诱导后NSCs进一步向神经细胞分化形态观察 把诱导后第7天神经干样球细胞进一步分化，次日细胞明显有细长突触长出，向双极或多极延伸，类似神经元形态，见图4。

图4 由NSCs分化的NCs形态图(×100)

3 讨论

本实验分离培养HADMSCs有几点改进:(1)分离中，消化细胞采用胶原酶没有用胰酶。胶原酶比胰酶对细胞的损伤小很多，这样使分离得到的HADMSCs具有更好的活性和增殖能力。(2)没有使用NH4Cl裂解脂肪中掺杂的红细胞，而利用红细胞不贴壁的特性，通过换液去除红细胞，这样也避免了对HADMSCs的损伤。(3)我们使用含5%FBS、2 ng/ml FGF-b的DMEMF12培养基培养HADMSCs。与大多采用的10%FBS的方法或不加FGF-b的方法比较，细胞活力更好，也更不易分化。

目前对HADMSCs鉴定还没有统一的标准，但普遍认为，HADMSCs最主要的两个表面标志是CD29和CD44，我们使用流式细胞仪检测HADMSCs表面标志物，结果显示表达CD29和CD44，不表达 CD45和 CD117，HADMSCs分离培养成功与否，主要看细胞分离获得率、细胞活力、细胞增殖能力和有无分化〔6〕。本实验改进的分离培养方法，在这几项上都有进步，为体外无分化扩增ADmSCs建立了一个很好的基础。

ADMSCs在不同诱导条件下可以向软骨、脂肪、心肌、平滑肌、肝、内皮和造血细胞分化〔6，7〕。目前ADmSCs向神经细胞的诱导均是在DMEM培养基基础上，应用EGF或FGF-b等生长因子〔8〕，在高(20%)或低(2%)浓度的胎牛血清条件下，加入一些诱导的药物，如β－巯基乙醇等诱导神经细胞，无论是诱导效率还是存活时间都不能令人满意。这就需要寻找新的诱导方法提高转化效率，我们运用shR-377联合IGF-1、EGF、FGF-b、SCF、BMP4及activinA等细胞因子进行筛选，重复性很好;从形态学来看，效果非常明显，2次转染后次日镜下观察，原来菱形、三角形等不规则形状70%以上都发生明显变化，细胞核隆起膨胀呈球形，细胞伪足收缩变细，向双极或多极延伸。收集诱导后第一日的细胞使用流式细胞仪检测nestin的表达与形态学变化基本吻合，而单转shR-377和单用细胞因子的诱导效果都不明显，可见shR-377和细胞因子的联合是高效率诱导HADMSCs向NSCs分化的一个好的选择。

本实验所用shR-377是一种短发夹结构的核酸，源于人体蛋白编码基因SH3PXD2B第一个内含子部位，与外源短发夹核酸类似。该短发夹核酸的茎部两条链完全互补，促进干细胞分化的原理为shR-377抑制EIA样的分化抑制因子(EID1)的表达，从而活化组蛋白乙酰化酶CBP/P300的表达。

1 Ji S，Gupta N，Weiss JN.The heart and its nerves:a nervous bond〔J〕．Heart Rhythm，2010;7(4):504-5.

2 Zeng Y，Qu X，Li H，et al.MicroRNA-100 regulates osteogenic differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cells by targeting BMPR2〔J〕．FEBSLett，2012;586(16):2375-81.

3 Yang Z，Bian C，Zhou H，et al.MicroRNA hsa-miR-138 inhibits adipogenic differentiation of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells through adenovirus EID-1〔J〕．Stem Cells Dev，2011;20(2):259-67.

4 Uchida N.MicroRNA-9 controls a migratory mechanism in human neural progenitor cells〔J〕．Cell Stem Cell，2010;6(4):294-6.

5 Doddapaneni R，Chawla YK，Das A，et al.Overexpression of microRNA-122 enhances in vitro hepatic differentiation of fetal liver-derived stem/progenitor cells〔J〕．JCell Biochem，2013;114(7):1575-83.

6 Zhang HT，Liu ZL，Yao XQ，et al.Neural differentiation ability of mesenchymal stromal cells from bone marrow and adipose tissue:a comparative study〔J〕．Cytotherapy，2012;14(10):1203-14.

7 Zavan B，Vindigni V，Gardin C，et al.Neural potential of adipose stem cells〔J〕．Discov Med，2011;10(50):37-43.

8 Ferroni L，Gardin C，Tocco I，et al.Potential for neural differentiation of mesenchymal stem cells〔J〕．Adv Biochem Eng Biotechnol，2013;129:89-115.