邱觅真+万权+张达颖

摘 要 胶原酶化学溶解术治疗腰椎间盘突出症在临床应用已40余年。研究表明胶原酶注入病变椎间盘后水解胶原分子为相关氨基酸，最终被机体吸收，但其水解的具体过程仍待进一步研究。近年临床研究证明：注射部位和剂量与安全效果高度相关；小剂量胶原酶突出物注射或盘内外联合注射可获较好远期效果；小剂量胶原酶注射联合射频可减少正常椎间盘水解，提高整体效果，并已在椎间盘突出症治疗中证实。胶原酶化学溶解术仍是临床经典、安全及有效的微创治疗方法。

关键词 胶原酶 腰椎间盘突出症 化学溶解术

中图分类号：R681.53； R977.3 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2016）17-0005-05

Research progress in collagenase chemonucleolysis for the treatment of lumbar intervertebral disc herniation

QIU Mizhen， WAN Quan， ZHANG Daying*

（Department of Pain， the First Hospital affiliated to Nanchang University， Nanchang 330006， China）

ABSTRACT The clinical application of collagenase chemonucleolysis in the treatment of lumbar intervertebral disc herniation has been lasted for more than 40 years. Many studies have shown that the collagenase which is injected into the intervertebral disc can hydrolyze the collagen into amino acids which are finally absorbed by the human body. However， the specific process for its hydrolysis remains to be further studied. In recent years， clinical research has proved that the site and dose for the injection of collagenase are highly correlated with its safety and efficacy. A long-term and good result can be obtained by injection of low-dose collagenase into the protrusion or combination of intradiscal and epidural injection. The normal hydrolysis of intervertebral disc can be reduced by injection of low-dose collagenase into the disc interior combined with radiofrequency and the overall effect can be improved， which has been confirmed in the treatment of intervertebral disc herniation. Collagenase chemonucleolysis is a minimally invasive treatment method with high safety and effectiveness.

KEY WORDS collagenase； lumbar intervertebral disc herniation； chemonucleolysis

胶原蛋白水解酶（简称胶原酶，collagenase），是一种高度特异性作用于胶原组织螺旋结构的蛋白水解酶。胶原酶化学溶解术（collagenase chemonucleolysis， CCNL）是指将外源性胶原酶注射到病变的椎间盘内或突出物周围，使胶原分子解链变性，最终降解为相关氨基酸，被机体中和吸收，从而使突出物减小或消失，以减轻其对神经组织的压迫，达到缓解或消除患者临床症状的治疗方法。

1968年美国学者Sussman [1]使用胶原酶对椎间盘组织进行体外溶解试验及动物实验，首次证实了胶原酶是具有专一水解胶原蛋白的特异性溶解酶，提出可用特异性的胶原酶来治疗腰椎间盘突出症（lumbar intervertebral disc herniation，LIDH），1981年又发表了胶原酶治疗29例LIDH患者取得成功的报道[2]。我国最早于1972年由上海医药工业研究院开始进行对胶原酶的研究，1975年始朱克闻等[3]开始使用国产注射用胶原酶用于临床治疗LIDH，并于1982年报道了对252例CCNL的随访疗效，证实了其极为明显的疗效与安全性。随后CCNL在国内外临床得到广泛应用，其注射方法由单纯椎间盘内或盘外注射发展到椎间盘内外联合注射，其确切的疗效以及较高的安全性获得临床广泛认同。近年来随着对解剖学、影像学、药理学和技术规范等方面的深入研究，CCNL治疗LIDH这一课题又取得了新的进展。

1 胶原酶的生物学特性与理化性质

注射用胶原酶多是由溶组织梭状芽孢杆菌（Clostridium histolyticum）发酵、经提取、精制、加入适量的赋形剂和稳定剂而制成的白色或类白色的冻干块状或粉末状物。国产注射用胶原酶[4]发酵单位稳定在200 U/ml以上，具有胶原酶活性的蛋白质与总蛋白的百分比在80%以上，产品质量可与国外高纯度胶原酶媲美。研究表明，其最适pH范围为6.7～8.0，胶原酶冻干制剂一旦配制成水溶液后，在常温下放置2 h时，其活性降低40%，6 h后活性降低75%[5]。胶原酶其本质是蛋白质，任何能改变蛋白质性质的物理、化学、生物等因素，均可能导致胶原酶的活性部分甚至全部丧失。

2 胶原酶的来源及作用机制

胶原酶按照其来源可分为微生物来源胶原酶和动物来源胶原酶。其中，微生物来源的胶原酶主要是细菌胶原酶，目前国内外临床使用的胶原酶多是由溶组织梭状芽孢杆菌发酵精制所得。细菌胶原酶与动物胶原酶主要不同点在于：①底物种类不同：梭菌胶原酶除7S基质胶原不能降解外，几乎能以同样的速度降解5种类型（I～V型）的胶原且对动物胶原酶不能降解的IV～V型也能轻易降解；②裂解方式不同：梭菌胶原酶可作用于胶原的多个位点，产生平均只有5个残基的小分子短肽，而动物胶原酶则作用于胶原N端3/4处Gly-Leu或Gly-Ile肽键，产生一个3/4片段和1/4片段；③获得的难易不同：因梭菌胶原酶可分泌到胞外，通过发酵可大量获得，而动物胶原酶则较难获得；④潜在的降解胶原能力不同：梭菌胶原酶具有更高的活性，微生物胶原酶溶解胶原纤维比动物胶原酶更彻底，且一般不需要其他蛋白酶辅助[6-8]。

胶原酶的作用机制可能有内源性和外源性两种途径。既往国内文献、书籍在引用胶原酶的作用机制多描述为：胶原酶是在胶原分子N端的3/4处使其解螺旋，将其水解成3/4和1/4 2个片段，然后进一步被其他蛋白酶水解成可吸收的氨基酸。这仅仅是介绍了内源性途径，而忽略了外源性途径；或是混淆了微生物源性胶原酶（外源性胶原酶）与内源性胶原酶两者的关系，作为医疗注射用胶原酶一般是从溶组织梭状芽孢杆菌发酵提取的微生物来源胶原酶，其作用的位点、方式和产物与内源性胶原酶均存在很大的差异。

目前比较公认的CCNL的作用机制是[9]：当外源性胶原酶以酶原的形式大量注入病变的椎间盘，会被其中的酶激活物激活而水解胶原分子，使之易解链变性；最终降解为脯氨酸、羟脯氨酸、赖氨酸等氨基酸，被机体中和吸收。但关于注射用胶原酶在体内究竟如何水解胶原分子尚存在争议，仍需进一步研究。

3 临床适应证与禁忌证

一般认为CCNL的经典适应证是：典型的神经根性症状与体征、并与MRI、CT影像学检查相符、经过3个月保守治疗仍无效的椎间盘突出症患者[10]。主要禁忌证有：①有明显脊髓或马尾神经损伤表现者；②合并骨性椎管狭窄或椎间孔狭窄；③突出物明显钙化或后纵韧带/黄韧带肥厚钙化；④椎间盘炎或椎间隙感染；⑤其他疾病或原因不适合手术者。适应证选择的恰当与否，直接关系到疗效的好坏，另外患者对手术的充分理解及术前、术中、术后的依从性也至关重要。

4 操作方法

CCNL的具体操作方法经过数十年的研究，目前已成规范，遵循胶原酶的作用机制和酶促反应动力学基本原理，“酶达底物，药达病所”是其基本原则，影像学监视和盘外注射行局麻药试验是安全保障，规范化操作是安全性和疗效基础。尽管胶原酶安全范围很广，但注入蛛网膜下腔是绝对禁忌，无论其何种操作技术，都应该遵循这些要素。

4.1 穿刺方法与入路

腰椎径路可分为经椎间孔入路、经椎板间隙入路、经骶裂孔入路（硬膜外前/侧间隙置管）、经小关节间隙入路，而经椎板间隙入路又可分为经小关节内缘入路（直接注射或向侧隐窝置管注射）、后正中穿刺入路（硬膜外后间隙注射或向侧隐窝置管注射）等[11]。

4.2 注射方法与剂量

CCNL在不同部位注射与临床效果有明显相关性，以往按注射方法的不同可大致分为盘内注射法、盘外注射法和盘内+盘外联合注射法，随着技术的发展，目前国内盛行“靶点注射”，不断研究出诸如突出物内注射法、突出物表面注射法及突出物内外联合注射法等，注射剂量也由原来推荐的盘外注射1 200～2 400 U、盘内注射600 U逐渐下降为盘外不超过1 200 U，盘内不超过200 U[12]，这也是“精准医学”的一个重要体现，现将其归纳综合叙述。

4.2.1 盘内注射法

是指把胶原酶注射到椎间盘内部，起到从内部直接溶解胶原组织的方法[13]，在国外多采用经典盘内法（即采用经椎间孔安全三角入路进行穿刺，针尖到达椎间盘中央处注药），适合于纤维环膨出型或纤维环未破裂的突出型，但对突出巨大及脱垂型或游离型则疗效欠佳。近年来临床更注重对椎间隙功能结构的保护，强调以突出物内注射为主的注射方法，使胶原酶和“靶点”底物直接接触，以期用最小的剂量发挥最大的作用，使突出物的体积缩小或消失，解除对神经组织的压迫。王胜利等[14]报道将胶原酶直接注射到突出物内是一种相对安全、有效的LIDH治疗方法。

4.2.2 盘外注射法

是指把胶原酶注射到椎间盘外（硬膜外腔），通过药液从表面渗透浸润突出物而从外到内溶解胶原组织的方法[15-16]，一方面胶原酶在硬膜外能直接溶解椎管内髓核组织，使髓核组织水解和吸收；另外胶原酶还具有抑制部分炎性介质活性的作用，减轻神经根的炎症水肿，起到缓解临床症状的效用。其主要有椎间孔入路硬膜外侧前间隙注射法、经小关节内缘侧隐窝注射法及骶裂孔硬膜外前间隙注射法三种，适合于纤维环破裂的突出型、脱垂型或游离型者。薄存菊等[17]采用经硬膜外导管泵注胶原酶治疗LIDH，认为有利于药物积聚于突出物周围，可提高治疗的长期效果，但多数临床应用证实其效果不稳定，可能与胶原酶配制后活性减灭有关，临床不予推荐。

4.2.3 盘内外联合注射法

由于盘外注射在部分病例中存在水解不充分、远期效果不佳、而盘内注射使椎间盘过度水解致椎间隙变窄、继发性椎间孔狭窄等问题，临床上设计了盘内（突出物）小剂量胶原酶注射联合盘外注射取得了较好效果。张学学等[18]认为胶原酶盘外与盘内外胶原酶注射均是治疗LIDH的有效方法，而盘内外联合注射胶原酶的远期疗效优于盘外注射法。陈家骅[19]报道在CT引导下首先将外套针穿刺至突出物表面行局麻药试验，再经外套针将内针刺入突出物内，分别经双针将胶原酶注射到突出物内及其表面的注射方法取得良好效果。

总之，合理选择注射方法与径路是保证CCNL安全和疗效的重要环节之一，对于不同形态、不同间隙的椎间盘出症，其操作方法都应该个体化、细节化。

5 疗效评价

国外报道的平均有效率在75%～77%，国内报道的平均有效率在70%～90%[20]。Couto等[21]一项Meta分析表明，CCNL在治疗LIDH方面疗效确切，优于安慰剂，但与手术疗效的比较却无法合理评价。Lewis等[22]在全球相关文献荟萃分析中依然肯定CCNL的中长期疗效，但遗憾的是仍缺乏大样本、多中心、方法科学、规范的高质量随机对照试验，有待进一步验证。大量的文献报道其中远期疗效达90%以上。

6 术后并发症及其处理

虽然CCNL在治疗LIDH方面疗效确切，但早期由于许多操作者无视操作常规，或对CCNL的基本理论掌握不足以及其他因素干扰，导致胶原酶误注蛛网膜下腔造成严重后果，使胶原酶的安全性一度备受争议，制约了该技术的应用与发展。近十年来技术操作不断规范，已无此类并发症的发生。

6.1 术后疼痛反应

盘内注射发生率较高，多发生在术后1周以内，其原因一般认为可能是胶原纤维在解链降解过程中，导致椎间盘体积增大和椎间盘内压增高，神经根压迫、炎症加重、椎管内窦椎神经受到激惹有关[23-24]。商卫林等[25]通过对山羊腰椎间盘退变模型注射胶原酶，认为盘内注射胶原酶对椎间盘软骨终板的损伤可能是导致术后疼痛的主要原因，但这可能是跟所使用的胶原酶的纯度或浓度有关。治疗上，医嘱术后卧床休息，以减少外力所致间盘压力增加；给予消炎止痛、脱水药物治疗，以减轻神经根充血水肿；必要时行硬膜外冲洗或注射消炎镇痛液消除神经根炎症[26]，并结合理疗及局部神经阻滞等综合治疗手段[27]，往往可有效缓解症状。

6.2 化学性脑脊膜炎

通常由胶原酶误入蛛网膜下腔引起，一旦发生后果很严重，国内已有相关报道[28]。认真遵守操作规程可杜绝事故的发生。张达颖[29]认为行CCNL必须在影像监测下规范操作，如拟行盘外胶原酶注射，除在影像上确认穿刺针到达突出物表面外，必须行2%利多卡因4 ml加地塞米松5 mg局麻药注射试验，观察15 min以上无脊髓麻醉后方可注射胶原酶，可有效避免误入蛛网膜下腔情况的发生。一旦不慎发生胶原酶蛛网膜下腔误注，应立即采取救治措施，积极予降颅压、营养神经、皮质醇激素冲击及脑脊液置换等治疗可能改善预后[29-30]。

6.3 神经损伤或功能障碍

可分术中与术后损伤。术中神经损伤多为操作不当致穿刺损伤脊神经根，术前仔细阅片，正确选择穿刺路径，术中影像监测下细心穿刺，多可避免发生，如一旦发生神经刺激症状，应该立即停止操作，分析原因，调整穿刺方向，必要时术后予神经营养及康复治疗。张学学等[31]研究表明术后神经损伤多发生在手术3 d以后，部分病例是由于椎间盘残余组织脱落对神经根的卡压造成，一旦发生宜立即手术减压。另有部分病例术中发现神经根受压不明显，可能与术后一过性压力增高，神经根缺血水肿及之后神经根鞘膜或脊膜变薄加之胶原酶的化学性刺激有关。治疗上及时行手术减压与冲洗，配合后期功能锻炼及康复治疗可明显改善预后。

6.4 尿潴留与肠麻痹

一般认为其机制一方面可能是由于椎间盘内压增加后椎管内窦椎神经受到刺激引起自主神经功能紊乱所致，另一方面是患者不习惯床上大小便等心理因素所致，可在治疗前给予心理干预、术前进行床上解大小便训练、注重饮食调整和适当的运动，必要时可行导尿处理，多可缓解[32-33]。

6.5 椎间隙感染

国内有少数病例报道。但若以预防为主，术中严格遵守无菌操作原则，则往往可避免这类感染发生。一旦感染发生，临床处理包括给予正规、足疗程的敏感抗生素治疗、腰部制动固定等，严重者需要穿刺减压、冲洗引流，椎间隙内臭氧注射治疗可取得较好效果[34]，极少数病例需开放手术。

6.6 脊柱失稳性腰背痛

一般认为系椎间盘被溶解后椎间隙变窄，椎间关节关节囊的窦返神经受到牵拉反应而出现反射性腰背部不适感和疼痛。术前严格把握适应证；尽量减少间隙内功能间盘的水解；术后避免过早起床活动及必要的康复指导对避免其发生有积极意义。

7 CCNL的多模式联合应用

CCNL这种经典微创技术在椎间盘突出症方面的确切疗效已经得到国际公认，而随着近年来微创介入技术的发展，国内外疼痛临床不断涌现出诸如低温等离子消融术、射频热凝术、旋切减压术、脊柱内镜技术等众多椎间盘微创技术联合CCNL的多模式联合应用[35-36]，均取得了较理想的治疗效果。Zhang等[37]报道小剂量胶原酶注射联合射频治疗LIDH，可保护椎间隙间盘组织，提高了临床效果，减少了术后腰痛及神经根损伤等并发症，拓宽了CCNL的适应证。吴新等[38]认为椎间孔镜联合胶原酶治疗脱出型LIDH的远期疗效较单纯孔镜者更可靠。

8 总结与展望

经过数十年的发展，CCNL微创手术的经济、简单安全、疗效确切持久等优点已获得国际认可，随着技术的不断成熟，胶原酶注射部位的精准化与剂量的最优化使CCNL的安全有效性进一步提升，其适应证除LIDH外，已扩展到颈椎间盘突出症的治疗[39-40]。CCNL多模式联合的成功应用，使其成为时下研究热点，也可能是未来的发展趋势。尽管椎间盘微创治疗技术很多，但CCNL效果明确、操作损伤小，安全性高，设备投入少等优势已是共识。如果能在深入相关基础研究的同时进一步开展中远期临床对照研究，强化操作技术规范化培训，防止不良事件的发生，CCNL仍将在LIDH的治疗上发挥独特而重要的作用。

参考文献

[1] Sussman BJ. Intervertebral discolysis with collagenase[J]. J Natl Med Assoc， 1968， 60（3）： 184-187.

[2] Sussman BJ， Bromley JW， Gomez JC. Injection of collagenase in the treatment of herniated lumbar disk. Initial clinical report[J]. JAMA， 1981， 245（7）： 730-732.

[3] 朱克闻， 董宏谋. 胶原酶髓核溶解术-252例疗效评述[J].医药工业， 1982， 13（8）： 15-20.

[4] 张蓓蕾， 於葆贞， 许海宝， 等. 注射用胶原酶研究[J]. 医学研究通讯， 2000， 19（9）： 20-21.

[5] 金星， 孟宪忠. 腰椎间盘突出症化学溶解术应用中的一些问题[J]. 中国脊柱脊髓杂志， 2000， 10（6）： 360-361.

[6] 金敏， 李君文， 王忠彦. 微生物胶原酶研究进展[J]. 氨基酸和生物资源， 2003， 25（1）： 3-7.

[7] 李文俊， 郭晓奎， 姜叙诚. 微生物胶原酶[J]. 微生物学杂志， 2004， 24（2）： 34-37.

[8] Zhang YZ， Ran LY， Li CY， et al. Diversity， structures， and collagen-degrading mechanisms of bacterial collagenolytic proteases[J]. Appl Environ Microbiol， 2015， 81（18）： 6098-6107.

[9] 孙涛， 宋文阁. 胶原酶化学溶解术再认识[J]. 中国疼痛医学杂志， 2013， 19（1）： 23-28.

[10] 张达颖. 胶原酶化学溶解术治疗腰椎间盘突出症的几点思考[J]. 中国疼痛医学杂志， 2006， 12（1）： 64.

[11] 张达颖. 腰椎间盘胶原酶化学溶解术的操作方法与径路选择[J]. 中国疼痛医学杂志， 2004， 10（3）： 192.

[12] 王志剑， 张学学， 翁泽林， 等. 靶点射频联合盘内小剂量胶原酶注射治疗腰椎间盘突出症的临床观察[J]. 中国疼痛医学杂志， 2011， 11（7）： 390-392.

[13] 商卫林， 李振宙， 侯树勋， 等. 胶原酶化学髓核溶解术机制的再研究[J]. 中国疼痛医学杂志， 2008， 14（3）： 147-150.

[14] 王胜利， 罗登攀. 突出物内注射胶原酶治疗腰椎间盘突出症56例分析[J]. 中国误诊学杂志， 2011， 11（1）： 188.

[15] 李振宙， 侯树勋， 刘茜， 等. 胶原酶对山羊硬膜外移植自体椎间盘组织溶解作用的观察[J]. 中国脊柱脊髓杂志， 2007， 17（11）： 862-864.

[16] 朱伟红， 朱海波， 马南， 等. 山羊腰椎间盘退变模型硬膜外胶原酶的注射[J]. 中国组织工程研究与临床康复， 2011， 15（26）： 4751-4754.

[17] 薄存菊， 卢振和， 陈金生， 等. 盘外泵注胶原酶治疗脱垂型腰椎间盘突出症的临床研究[J]. 中国疼痛医学杂志， 2014， 20（9）： 646-649.

[18] 张学学， 王志剑， 翁泽林， 等. 盘外与盘内外胶原酶注射治疗腰椎间盘突出症的临床效果[J]. 临床麻醉学杂志， 2012， 28（1）： 43-45.

[19] 陈家骅. 腰椎间盘突出物定向靶位注射胶原酶化学溶解术[J]. 中国疼痛医学杂志， 2004， 10（2）： 128.

[20] 刘延青， 崔健君. 实用疼痛学[M]. 北京： 人民卫生出版社， 2013： 415.

[21] Couto JM， Castilho EA， Menezes PR. Chemonucleolysis in lumbar disc herniation： a meta-analysis[J]. Clinics （Sao Paulo）， 2007， 62（2）： 175-180.

[22] Lewis R， WiIliams N， Matar HE， et a1. The clinical effectiveness and cost-effectiveness of management strategies for sciatica： systematic review and economic model[J]. Health Technol Assess， 2011， 15（39）： 1-578.

[23] Brown MD， Tompkins JS. Pain response postchemonucleolysis or discexcision[J]. Spine， 1989， 14（3）： 321-326.

[24] 武春银， 陈家骅. 胶原酶治疗腰椎间盘突出症术后疼痛加重的原因分析[J]. 中国疼痛医学杂志， 2008， 14（6）： 372-375.

[25] 商卫林， 刘宁， 李振宙， 等. 胶原酶髓核溶解术后疼痛反应的机理——动物实验研究[J]. 中国骨肿瘤骨病， 2008， 7（2）： 100-103.

[26] 赵丽， 宋阳， 朱本藩， 等. 胶原酶溶核术后疼痛加重患者硬膜外冲洗术治疗的疗效分析[J]. 中国疼痛医学杂志， 2012， 18（6）： 347-349.

[27] 李树生. 腰椎间盘突出症术后残余腰腿痛的诊治[J]. 中国疼痛医学杂志， 2013， 19 （10）： 638-640.

[28] 吴川杰， 连亚军， 张璐. 胶原酶误渗入蛛网膜下腔1例报告[J]. 中国疼痛医学杂志， 2012， 18 （6）： 382-383.

[29] 张达颖. 胶原酶化学溶解术治疗腰椎间盘突出症不良事件的防治[J]. 中国疼痛医学杂志， 2007， 13（6）： 380.

[30] 刘祥荣， 姚本礼， 马永. 胶原酶靶点注射意外渗入蛛网膜下腔处理1例报告[J]. 中国疼痛医学杂志， 2014， 20（11）： 844-846.

[31] 张学学， 张达颖， 章勇， 等. 腰椎间盘胶原酶化学溶解术后神经根损伤的回顾性分析[J]. 临床麻醉学杂志， 2011， 27（10）： 973-975.

[32] 熊根玉， 张达颖. 大量饮水法加心理干预对预防溶盘术后尿潴留的效果[J]. 南昌大学学报（医学版）， 2010， 50（11）： 21-23.

[33] 张华秀， 魏建梅， 曾春娥. 腰椎间盘突出症胶原酶化学溶解术后患者发生便秘的原因分析及护理干预[J]. 实用临床医学， 2012， 13（7）： 97-98.

[34] 江海亮， 潘剑成， 张宗明， 等. 五例原发性腰椎间盘炎的臭氧治疗分析[J]. 介入放射学杂志， 2012， 21（2）： 165-167.

[35] 徐霖， 彭力， 黄翘胜， 等. 等离子射频消融髓核后椎间盘内外注射小剂量胶原酶的溶核效应[J]. 中国组织工程研究与临床康复， 2008， 12（32）： 6323-6326.

[36] 张绍杰， 侯会文， 刘洋， 等. 经皮旋切术联合胶原酶靶点溶解治疗颈椎间盘突出症[J]. 中国疼痛医学杂志， 2011， 17（3）： 160-162.

[37] Zhang DY， Zhang Y， Wang ZJ， et al. Target radiofrequency combined with collagenase chemonucleolysis in the treatment of lumbar intervertebral disc herniation[J]. Int J Clin Exp Med， 2015， 8（1）： 526-532.

[38] 吴新， 杨沁岩， 张 鹏， 等. 经皮椎间孔镜联合胶原酶治疗脱出型腰椎间盘突出症的疗效[J]. 中国内镜杂志， 2015， 21（5）： 509-512.

[39] 张达颖， 王志剑， 张学学， 等. 颈前入路射频联合盘内小剂量胶原酶注射治疗颈椎间盘突出症[J]. 中国疼痛医学杂志， 2015， 21（2）： 121-124.

[40] Wang ZJ， Zhu MY， Liu XJ， et al. Cervical intervertebral disc herniation treatment via radiofrequency combined with low-dose collagenase injection into the disc interior using an anterior cervical approach[J/OL]. Medicine （Baltimore）. 2016， 95（25）： e3953. doi： 10.1097/MD.0000000000003953.