张凤英，乔立君，张金玉，薛美兰，葛银林

(1 青岛大学医学院生物化学与分子生物学教研室，山东 青岛 266021; 2 菏泽医学专科学校)



联合下调Survivin和KSP表达对乳癌细胞MDA-MB-231凋亡影响

张凤英1，2，乔立君1，张金玉1，薛美兰1，葛银林1

(1 青岛大学医学院生物化学与分子生物学教研室，山东 青岛 266021; 2 菏泽医学专科学校)

目的 探讨联合下调Survivin和纺锤体驱动蛋白(KSP)基因表达对乳癌细胞增殖和凋亡影响。方法分别化学合成针对Survivin和KSP基因mRNA的小干扰RNA(siRNAs)，分别或联合转染乳癌细胞MDA-MB-231，以空白对照组作为阴性对照。采用MTT法检测细胞增殖率，荧光定量PCR (qRT-PCR)检测Survivin、KSP、Bax和Bcl-2的mRNA表达，蛋白印迹法检测Survivin和KSP的蛋白表达，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果Survivin、KSP和Survivin+KSP转染组转染48 h的细胞增殖率分别为0.66±0.01、0.67±0.03、0.54±0.01，转染72 h的细胞凋亡率分别为(11.61±0.89)%、(16.33±0.94)%、(45.73±1.11)%，与空白对照组相比差异有统计学意义(F=1 307.81、1 450.76，P<0.01)，其中以双干扰组细胞增殖率最低、凋亡率最高。在各转染组中，Survivin、KSP的mRNA和蛋白表达水平均显著下降(F=48.68～490.20，P<0.01)，Bax mRNA的表达显著增加(F=65.73，P<0.01)，Bcl-2 mRNA的表达显著减少(F=27.41，P<0.01)。结论 利用siRNAs联合下调Survivin和KSP基因表达，能有效抑制乳癌细胞的增殖、促进其凋亡，效果优于下调单个基因的表达。

乳房肿瘤；凋亡抑制蛋白质类；驱动蛋白；RNA干扰

实验室和临床研究都证实，肿瘤细胞的生长繁殖与若干癌基因和抑癌基因的表达异常有关，其中重要的有Survivin和纺锤体驱动蛋白(KSP) 基因。Survivin基因是近年发现的凋亡抑制蛋白(IAP)家族新成员，具有强大的调节细胞增殖以及抗凋亡的能力，高表达于各种恶性肿瘤组织及胚胎组织，如乳癌组织[1]，而在正常组织(胸腺、生殖器除外)细胞中水平较低或不表达。KSP是驱动蛋白5亚家族中的一员[2]，在细胞有丝分裂早期，对双极纺锤体的形成、复制、染色体的分离和中心体的分裂等有丝分裂过程起着重要的作用[3]。除此之外，KSP还与肿瘤的发生和发展紧密相关，在很多肿瘤细胞系中高表达(如乳癌[4])，已成为近年一个重要的肿瘤化疗的新靶点[5]。理论上，抑制高表达的癌基因，就可抑制癌细胞的增殖或使其凋亡。小干扰RNA(siRNAs)技术具有特异性高、效果好、制备容易、操作简便等优点，已成为抑制基因表达的首选方法。本研究拟通过联合转染Survivin和KSP 的siRNAs，抑制这两种基因在乳癌细胞中的表达，探讨其对细胞生长能力、侵袭能力的影响，为乳癌的基因治疗提供新策略。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人乳癌细胞株MDA-MB-231购自中国医学科学院基础医学研究所。

1.1.2 主要试剂 脂质体LipofectamineTM2000购自美国Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI染色试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；MTT试剂盒购自美国Sigma公司；兔抗人Survivin、KSP多克隆抗体购自美国Biolengend公司；β-actin一抗和二抗购自武汉博士德生物工程有限公司；特异性靶向Survivin、KSP基因及scramble的siRNAs由上海吉玛公司合成。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 人乳癌细胞株MDA-MB-231经复苏后，加入含有体积分数0.10胎牛血清(FBS)的DMEM培养液，在37 ℃、含体积分数0.05 CO2的恒温密闭式培养箱中培养，每2～3 d传代1次。

1.2.2 细胞转染及分组 将MDA-MB-231细胞接种于6孔培养板中，待细胞密度为4×108/L、细胞融合度达60%～70%时进行转染。转染时分组如下：空白对照组(A组)，阴性对照组(B组，转染scramble siRNAs)，Survivin转染组(C组)，KSP转染组(D组)，Survivin+KSP转染组(E组，转染Survivin和KSP的siRNAs各半)。转染siRNAs的终浓度均为100 nmol/L。将配制的siRNAs-LipofectamineTM2000混和液加入含有细胞的培养孔中，使每孔总体积为2 mL，置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中培养5 h后，更换新鲜的培养液继续培养48 h，观察siRNAs抑制效果。

1.2.3 MTT检测细胞增殖 将MDA-MB-231细胞接种于96孔板中，细胞密度为1.5×107/L；置于37 ℃、含体积分数0.05 CO2的培养箱中培养，待细胞贴壁后，各组加入终浓度为100 nmol/L的相应siRNAs；分别在转染24、48、72 h后，每孔加入新鲜配制的10 g/L MTT 20 μL，继续培养4 h；弃上清液，每孔加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，震荡10 min；用酶联免疫检测仪于波长490 nm处测定每孔吸光度(A)值，以不含细胞的培养液作空白对照，最后结果取3个平行孔的均值。实验重复3次。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡情况 转染后72 h收集106个细胞，用预冷PBS洗涤，1 000 r/min离心3 min，反复3次。弃上清液，收集细胞，混匀沉淀，快速加入体积分数0.75的冷乙醇中，4 ℃固定24 h，采用Annexin V-FITC/PI试剂盒双染法检测各组细胞凋亡率。实验结果以流式四象限散点图表示，每个样品重复检测3次。

1.2.5 荧光定量PCR(qRT-PCR)检测相关指标mRNA表达 转染48 h后，用Trizol试剂提取各组的总RNA，用反转录试剂盒进行cDNA链的合成。PCR反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72℃ 30 s，72 ℃ 10 min，共40个循环。以A组mRNA的表达量为标准，计算其他组mRNA的相对表达量，结果以2-△△CT表示。qRT-PCR所用引物名称及其序列见表1。

表1 qRT-PCR所用引物名称及其序列

1.2.6 蛋白印迹法检测Survivin和KSP蛋白表达转染72 h后，收集细胞提取总蛋白，用BCA法进行浓度测量，取50 μg蛋白置100 g/L SDS-PAGE凝胶上进行电泳，电泳结束后转移蛋白至PVDF膜上，以50 g/L脱脂奶粉室温封闭2 h，加入1∶200稀释的兔抗人Survivin、KSP一抗，室温作用3 h，TBST洗膜，加入1∶2 000稀释的羊抗兔IgG/HRP，室温温育1 h，TBST洗膜，DAB显色。以β-actin为内参，用quantity one软件分析各条带灰度值，计算Survivin和KSP蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1 转染siRNAs对MDA-MB-231细胞增殖影响

与A组相比，各siRNAs组各时间点的细胞增殖率均有所下降，以E组下降最明显，差异均有统计学意义(F=1 307.81～3 674.31,P<0.01)。E组转染48 h的细胞增殖率较转染24 h显著下降(F=7.203，P<0.01)，但转染48 h与转染72 h的细胞增殖率差异无显著性(P>0.05)。见表2。

2.2 转染48 h后各组细胞形态学观察

A、B组细胞形态良好，呈梭状，两组差异不明显；C、D组凋亡细胞增多，细胞变圆，且两组细胞凋亡数目无明显差异；E组细胞凋亡最显著，圆形细胞增多。见图1。

2.3 转染siRNAs对MDA-MB-231细胞凋亡影响

转染后72 h，C、D、E组细胞的凋亡率分别为(11.61±0.89)%、(16.33±0.94)%和(45.73±1.11)%，各组细胞凋亡率高于A组(5.29±0.09)%和B组(5.17±0.032)%，且以E组的细胞凋亡率最高，差异均有统计学意义(F=1 450.76，P<0.01)；A组与B组细胞凋亡率差异无显著性(P>0.05)。

2.4 转染siRNAs对相关指标mRNA和蛋白表达的影响

A、B组细胞Survivin、KSP、Bax和Bcl-2基因mRNA的表达比较差异无显著意义(P>0.05)；与A组相比较，C、E组Survivin mRNA和蛋白的表达水平均明显降低(F=299.70、490.20，P<0.01)，D、E组KSP mRNA和蛋白的表达水平也明显降低(F=76.64、48.68，P<0.01)，C、D、E组Bax mRNA的表达水平明显升高(F=65.73，P<0.01)，C、D、E组Bcl-2 mRNA的表达则显著减少(F=27.41，P<0.01)。以上各指标检测结果均以E组变化最为明显。见表3。

表2 各组细胞增殖率的比较

A：空白对照组；B：阴性对照组；C：Survivin转染组；D：KSP转染组；E：Survivin+KSP转染组。100倍。

表3 各组相关指标mRNA和蛋白表达的比较

3 讨 论

近半个世纪以来，随着工业化的发展，乳癌发病率和死亡率一直呈明显的上升趋势，但目前还没有完全有效的药物治疗乳癌。越来越多的研究表明，siRNAs技术能有效抑制癌细胞的增殖。因此，寻找有效的siRNAs靶位点可能会成为最热门的癌症治疗手段之一。

Survivin是目前发现的惟一与细胞凋亡和细胞周期调控均相关的IAP家族成员。Survivin在细胞周期的G2/M期特异性表达，在细胞有丝分裂期间，它通过特异性结合到纺锤体的微管蛋白上来实现对细胞分裂的调控[6]。因此，Survivin对维持快速增殖细胞的存活、肿瘤细胞的恶性增殖及其分化具有重要功能[7]。一些研究指出，Survivin主要通过抑制半胱氨酸蛋白酶Caspase-3及Caspase-9的活性，阻断各种刺激因素诱导的细胞凋亡过程[8-10]，抑制血管内皮细胞的凋亡，参与肿瘤血管生成[11]。下调Survivin后可以上调Bax和BAD的表达水平，下调Bcl-2的表达，促进细胞凋亡[12-13]。本文研究结果显示，转染靶向Survivin的siRNAs，可有效下调Survivin mRNA和蛋白的表达水平。随着Survivin表达的下调，Bcl-2的表达水平显著下调，Bax的表达水平上调，细胞凋亡程度明显增高。本文的研究结果与相关文献报道一致[14]，说明我们所设计合成的Survivin siRNAs可有效促进肿瘤细胞凋亡。

KSP具有驱动蛋白家族保守的ATP酶结构域和动力结构域，在有丝分裂前中期，对双极纺锤体的形成分离过程有重要的作用[15]。有研究显示，针对KSP的siRNAs能够导致单星状纺锤体的产生，促使有丝分裂阻滞在M期，并诱导肿瘤细胞凋亡[16]。也有研究表明，KSP高表达于人体恶性增殖的组织细胞中，其表达水平与细胞增殖指数、有丝分裂比例及肿瘤的生长速度有相关性[17]。KSP蛋白参与细胞的有丝分裂，人体正常分裂增殖的组织细胞中也存在KSP的表达，但其表达水平明显低于恶性组织；在人体正常分化成熟的组织细胞中，如神经细胞中未检测到KSP的表达[18]。因此，抑制KSP能够抑制细胞的有丝分裂，使细胞停止增殖。本研究使用siRNAs抑制KSP表达后，细胞凋亡率显著增加，这表明下调KSP表达可有效抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。TAO等[19]的研究表明，抑制KSP可以激活Bax、caspase3等凋亡基因，从而促进肿瘤细胞凋亡。有研究结果显示，下调KSP表达可以提高Bax/Bcl-2的比值[20]。本研究结果与之相符。

在大多数实体恶性肿瘤组织中，包括乳癌、神经母细胞瘤和肺癌，Survivin和KSP的表达均上调，与肿瘤的恶性行为相关[21]。因此，越来越多的研究将Survivin和KSP作为癌症治疗的靶位点。目前，KSP siRNAs和血管内皮生长因子siRNAs联合干扰已经用于人体研究，效果显著[21]。然而，目前还未见同时靶向Survivin和KSP的siRNAs对乳癌细胞增殖、凋亡、侵袭影响的研究报道。因此，本研究应用化学合成的siRNAs，转染MDA-MB-231细胞，同时特异性抑制Survivin和KSP基因的表达。本文的研究结果显示，双干扰组细胞凋亡率明显高于单干扰组。同样，Survivin和KSP的表达在双干扰组降低最显著。

综上所述，利用siRNAs同时下调Survivin和KSP基因的表达，抑制乳癌细胞的生长效果显著高于单独下调任何一种基因的表达；Survivin和KSP可以作为肿瘤治疗的两个重要靶标；联合下调Survivin和KSP可作为乳癌治疗的参考。本文结果为多基因共沉默抑制肿瘤细胞的生长提供了实验依据，也为利用siRNAs进行肿瘤基因治疗提供了有意义的尝试。

[1] SONG J, SU H, ZHOU Y Y, et al. Prognostic value of survivin expression in breast cancer patients: a meta-analysis[J]. Tumour Biol, 2013,34(4):2053-2062.

[2] LAWRENCE C J, DAWE R K, CHRISTIE K R, et al. A standardized kinesin nomenclature[J]. J Cell Biol, 2004,167(1):19-22.

[3] KINOSHITA M, WATANABE N. Small molecule inhibitor of mitotic spindle bipolarity identified in a phenotype-based screen[J]. Tanpakushitsu Kakusan Koso, 2007,52(13 Suppl):1796-1799.

[4] 卢正磊,任维华,荚卫东,等. 驱动蛋白Eg5在肝细胞癌中的表达及其意义[J]. 安徽医科大学学报, 2012,47(9):1091-1094.

[5] WOJCIK E J, BUCKLEY R S, RICHARD J, et al.Kinesin-5: cross-bridging mechanism to targeted clinical therapy[J]. Gene, 2013,531:133-149.

[6] LI F, AMBROSINI G, CHU E Y, et al. Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin[J]. Nature, 1998,396(6711):580-584.

[7] 孙瑶,雷炜. RNA干扰survivin基因对HepG2细胞凋亡及化疗影响[J]. 齐鲁医学杂志, 2012,25(4):303-308.

[8] 王滋宗,魏煜程,沈毅,等. 非小细胞肺癌组织Survivin和Caspase基因表达及其关系[J]. 青岛大学医学院学报, 2008,44(1):22-23.

[9] 李元宏,常冰梅. RNA干扰survivin基因对宫颈癌细胞中survivin蛋白表达及caspase-3酶活性的影响[J]. 中国医药导报, 2012,9(22):22-23.

[10]THEODOROULOS G E, MICHALOPOULOS N V, PANOUSSOPOULOS S G, et al. Effects of caspase-9 and survivin gene polymorphisms in pancreatic cancer risk and tumor cha-racteristics[J]. Pancreas, 2010,39(7):976-980.

[11]WANG P, ZHEN H, ZHANG J, et al. Survivin promotes glioma angiogenesis through vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor in vitro and in vivo[J]. Mol Carcinog, 2012,51(7):586-595.

[12]GOU X, YANG H A, HE W Y, et al. Gene silence-induced downregulation of survivin inhibits bladder cancer cells[J]. Oncol Res, 2011,19(12):535-541.

[13]HOSSAIN M M, BANIK N L, RAY S K. Survivin knockdown increased anti-cancer effects of (-)-epigallocatechin-3-gallate in human malignant neuroblastoma SK-N-BE2 and SH-SY5Y cells[J]. Exp Cell Res, 2012,318(13):1597-1610.

[14]KAPPLER M, BACHE M, BARTEL F, et al. Knockdown of survivin expression by small interfering RNA reduces the clonogenic survival of human sarcoma cell lines independently of p53[J]. Cancer Gene Ther, 2004,11(3):186-193.

[15]KAPITEIN L C, PETERMAN F J, KWOK B H, et al. The bipolar mitotic kinesin Eg5 moves on both microtubules that it crosslinks[J]. Nature, 2005,435(7038):114-118.

[16]MARRA E, PALOMBO F, CILIBERTO G, et al. Kinesin spindle protein SiRNA slows tumor progression[J]. J Cell Physiol, 2013,228(1):58-64.

[17]NAGARAJAN S,SKOUFIAS D A, KOZIELAKI F, et al. Receptor-ligand interaction-based virtual screening for novel Eg5/kinesin spindle protein inhibitors[J].

J Med Chem, 2012,55(6):2561-2573.

[18]SAKOWICZ R, FINER J T, BERAUD C, et al. Antitumor activity of a kinesin inhibitor[J]. Cancer Res, 2004,64(9):3276-3280.

[19]TAO W, SOUTH V J, DIEHL R E, et al. An inhibitor of the kinesin spindle protein activates the intrinsic apoptotic pathway independently of p53 and de novo protein synthesis[J]. Mol Cell Biol, 2007,27(2):689-698.

[20]JIANG C, YANG L, WU W T, et al. CPUYJ039, a newly synthesized benzimidazole-based compound, is proved to be a novel inducer of apoptosis in HCT116 cells with potent KSP inhibitory activity[J]. J Pharm Pharmacol, 2011,63(11):1462-1469.

[21]TABERNERO J, SHAPIRO G I, LORSSO P M, et al. First-in-humans trial of an RNA interference therapeutic targeting VEGF and KSP in cancer patients with liver involvement[J]. Cancer Discov, 2013,3(4):406-417.

(本文编辑 马伟平)

EFFECTS OF COMBINED DOWN REGULATION OF EXPRESSIONS OF SURVIVIN AND KSP ON APOPTOSIS OF BREAST CAN-CER CELL MDA-MB-231

ZHANGFengying,QIAOLijun,ZHANGJinyu,XUEMeilan,GEYinlin

(Department of Biochemistry, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China)

ObjectiveTo investigate the effects of combined down regulation of expressions of Survivin and kinesin spindle protein (KSP) on proliferation and apoptosis of human breast cancer cells (MDA-MB-231).MethodsSmall interfering RNAs (siRNAs) targeting Survivin and KSP mRNA were chemically synthesized and jointly or separately transfected to breast cancer cells (MDA-MB-231). A blank control group was served as negative control. Employing MTT method to measure the cell proliferation rate, qRT-PCR to detect the expressions of Survivin, KSP, Bax and Bcl-2 mRNA, Western blotting to detect the expressions of Survivin and KSP proteins, and flow cytometry to detect the cell apoptosis.ResultsAfter 48 hours of transfection, the cell proliferation rates in Survivin, KSP and Survivin+KSP groups were 0.66±0.01, 0.67±0.03, and 0.54±0.01, respectively, and the apoptotic rates were (11.61±0.89)%, (16.33±0.94)%, and (45.73±1.11)%, respectively, the differences were statistically significant as compared with the blank control group (F=1 307.81,1 450.76;P<0.01), of which, the lowest rate of cell proliferation and the highest rate of apoptosis were noted in double-interference group. In each transfection group, the mRNA and protein expressions of Survivin and KSP were significantly declined (F=48.68-490.20,P<0.01), the expression of Bax mRNA increased (F=65.73,P<0.01), and the mRNA expression of Bcl-2 reduced (F=27.41,P<0.01).ConclusionApplyingsiRNAs to jointly down regulation of both Survivin and KSP expressions can more effectively inhibit the proliferation and promote apoptosis of breast cancer cells than down-regulating the expression of individual gene.

breast neoplasms; inhibitor of apoptosis proteins; kinesin; RNA interference

2015-01-22;

2015-06-06

青岛市科技局科研基金资助项目(07-2-1-7-nsh)

张凤英(1973-)，女，硕士研究生，讲师。

葛银林(1957-)，男，博士，教授，博士生导师。

R737.9

A

1008-0341(2015)04-0402-05