李敏，王蓁，刘磊，董娴宁，王冠群，李莎

(青岛大学附属医院，山东 青岛 266003； 1 妇科； 2 产科； 3 病理科)



宫颈鳞癌组织HPV16型E6与P73蛋白表达及其关系

李敏1，王蓁1，刘磊2，董娴宁3，王冠群3，李莎1

(青岛大学附属医院，山东 青岛 266003； 1 妇科； 2 产科； 3 病理科)

目的 研究人乳头瘤病毒(HPV)16型E6蛋白(HPV16-E6蛋白)与P73蛋白在宫颈鳞癌组织中的表达及两者的相关性，探讨HPV16-E6蛋白、P73蛋白在宫颈肿瘤发生、发展过程中的作用。方法 选取正常宫颈组织10例、宫颈上皮内瘤样病变(CIN)组织22例、宫颈鳞癌组织38例，采用PV-6000二步法检测3种组织中HPV16-E6、P73蛋白的表达情况,分析两者与相关临床病理参数间的关系及两者之间的相关性。结果 鳞癌组HPV16-E6蛋白的表达明显高于正常组、CIN组，差异有统计学意义(χ2=21.703，P<0.05)。鳞癌组P73蛋白表达明显低于正常组、CIN组，差异有统计学意义(χ2=15.461，P<0.05)。宫颈鳞癌组织中HPV16-E6蛋白阳性表达率与组织学分级显著相关(χ2=9.011，P<0.05)；与发病年龄、临床分期、淋巴结转移及肿瘤大小无关(P>0.05)。HPV16-E6蛋白与P73蛋白的阳性表达呈负相关(rs=-0.301,P<0.05)。结论 HPV16-E6蛋白表达升高可能与宫颈鳞癌的发生、发展相关。随着宫颈肿瘤发展程度的增高,P73蛋白的表达逐渐降低,提示p73基因可能是宫颈肿瘤的抑癌基因。

宫颈肿瘤；宫颈上皮内瘤样病变；人乳头状瘤病毒16；免疫组织化学

宫颈癌是常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，其中鳞癌是最主要的类型，占80%～85%[1]。宫颈癌的主要致病因素包括人乳头瘤病毒(HPV) 感染, 尤以HPV16型(HPV16)常见。而高危型HPV16-E6蛋白在肿瘤的发生发展中起重要作用。HPV16-E6蛋白通过E6-AP的介导，结合并降解肿瘤抑制蛋白P53蛋白，最终导致肿瘤发生。近来研究显示，p73 基因是p53 基因家族的新成员,具有与p53基因相似的结构与功能，能转录性激活 p53 的靶基因并以 p53 相似的方式诱导细胞凋亡。但P73蛋白与HPV16-E6 蛋白之间是否有作用、两者的相关性如何，以及其在 E6 致癌机制中的作用还有待于进一步研究探讨。因此，本研究检测了宫颈鳞癌组织中HPV16-E6蛋白及P73 蛋白的表达，旨在探讨两者的相关性及在宫颈肿瘤发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

随机选取我院妇科2010年1月—2014年7月存档的在该院行手术治疗、且经病理确诊为宫颈癌的标本38例及宫颈上皮内瘤变(CIN)组织标本22例,随机选取同期因子宫肌瘤行全子宫切除术的正常宫颈组织标本10例作为对照组。宫颈癌组按细胞分化程度分为高分化4例,中分化12例,低分化22例；根据2009年国际妇产科联盟分期标准:Ⅰ期26例,Ⅱ期12例；按病理类型分类均为鳞癌;术后病理证实有淋巴结转移8例，无淋巴结转移30例。病人年龄33～61岁，中位年龄46岁。CIN组Ⅰ级7例,Ⅱ级5例,Ⅲ级10例;病人年龄38～60岁，中位年龄48岁。对照组年龄45～65岁，中位年龄49岁。所有病例均未接受过放化疗治疗，均经病理检查确诊。各组年龄、体质量比较差异均无显著性，具有可比性。

1.2 试剂来源

兔抗人HPV16-E6多克隆抗体、兔抗人P73多克隆抗体、DAB试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司；即用型PV-6000试剂购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3 实验方法

所有标本均经甲醛溶液固定，石蜡包埋,4 μm厚连续切片，采用PV-6000二步法进行免疫组织化学染色。HPV16-E6和P73的抗体工作浓度均为1∶200。所有切片均采用高压抗原热修复(切片浸入0.01 mol/L、pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液中沸浴15 min)，DAB显色，苏木精复染，用已知阳性标本作阳性对照(HPV16-E6为宫颈鳞癌,P73为正常皮肤)，用PBS代替一抗作阴性对照。

1.4 结果判定

以细胞核或(和)细胞浆被染成黄色为HPV16-E6蛋白、P73蛋白阳性表达。结果采用半定量综合法计分。用OLYMPUS照相显微镜计算阳性细胞数。先在100倍光镜下找到癌巢，再用400倍光镜随机取5个视野计数阳性细胞并取平均值，根据平均阳性细胞所占百分比及染色强度计分。阳性细胞所占百分比：无阳性细胞为0分，阳性细胞≤10%为1分，11%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。染色强度：细胞无染色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。以阳性细胞所占百分比与染色强度的乘积≥3分为阳性。

2 结 果

2.1 HPV16-E6与P73蛋白的表达

HPV16-E6蛋白的阳性表达分布于细胞核、细胞质。CIN组及鳞癌组织中HPV16-E6蛋白阳性表达率分别为40.9%和78.9%，而在正常宫颈组织未见表达。鳞癌组HPV16-E6蛋白表达明显高于正常组、CIN组，差异有显著意义(χ2=21.703，P<0.05)。HPV16-E6蛋白在CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ组的阳性表达率分别为42.9%、40.0%、40.0%，组间比较差异无显著性(P>0.05)。

P73蛋白的阳性表达分布于宫颈鳞状上皮的基底细胞核。正常宫颈组、CIN组及鳞癌组P73蛋白阳性表达率分别为80.0%、59.1%和21.1%。鳞癌组P73蛋白的表达明显低于正常组和CIN组，差异有显著意义(χ2=15.461，P<0.05)。P73蛋白在CINⅠ、CINⅡ及CINⅢ组阳性率分别为71.4%、60.0%、50.0%，组间差异无显著性(P>0.05)。

2.2 HPV16-E6和P73蛋白表达与宫颈癌临床病理特征的关系

HPV16-E6蛋白表达与宫颈癌组织学分级有关(χ2=9.011，P<0.05)，与临床分期、淋巴结转移、肿瘤大小、发病年龄无关(P>0.05)。P73蛋白的表达与临床病理特征均无关(P>0.05)。见表1。

2.3 HPV16-E6蛋白及P73蛋白表达的相关性

HPV16-E6与P73蛋白在宫颈组织中的表达呈负相关(rs=-0.301,P<0.05)。见表2。

表1 宫颈癌组织中HPV16-E6和P73蛋白表达与临床病理特征的关系(例)

表2 HPV16-E6和P73蛋白在宫颈组织表达相关性(例)

3 讨 论

生殖道HPV感染与宫颈癌的关系十分密切，该理论最早在1974年被提出[2]。在HPV的各亚型中，高危型HPV可引起宫颈癌等恶性肿瘤，尤以HPV16多见[3]。HPV16-E6基因是病毒感染后表达的早期基因，其编码的E6蛋白与E6-AP相互作用，可以降解肿瘤抑制因子p53，从而影响细胞的生长。但这并非E6蛋白致癌惟一途径[4]。本文研究结果显示，HPV16-E6蛋白在鳞癌组的表达明显高于正常组、CIN组，差异有显著性，且HPV16-E6蛋白表达的阳性率由正常→CIN→鳞癌逐渐升高，提示HPV16-E6蛋白表达升高可能与宫颈鳞癌的发生、发展相关。

p53基因是重要的抑癌基因，在多数恶性肿瘤组织中表达下调[5]。目前认为是由于HPV感染宫颈上皮后，其表达产物E6蛋白结合并降解p53，使之表达下调从而导致宫颈癌的发生。早在1997年，KAGHAD等发现了一个定位于1P36的新基因，即p73基因，其基因产物P73蛋白具有与p53同样的4个主要功能区，以及与p53相似的E6结合模体，即VNQLVGQ序列[6-7]。p73作为p53家族的一员，基因结构和功能与p53基因具有同源性，很可能是HPV16-E6作用的另一重要靶分子，人们推测其亦为抑癌基因[8]。那么P73能否同样被HPV的病毒癌基因E6结合并降解？研究表明，虽然HPV16-E6蛋白能抑制p73转录激活及其靶基因p21等的表达，但不能降解P73蛋白。例如，PARK等[9]研究显示，HPV16-E6蛋白结合P73蛋白的转录激活区，一过性降低P73的活性。本研究结果显示，P73蛋白在正常宫颈组、CIN组及鳞癌组的阳性表达率分别为80.0%、59.1%和21.1%，这种在正常鳞状上皮高表达、在癌组织低表达的情况与NENUTIL等[10]的研究结果一致。鳞癌组P73蛋白表达明显低于正常组、CIN组，三者间差异有显著意义；P73蛋白表达的阳性率由正常→CIN→鳞癌逐渐降低，且与HPV16-E6蛋白的表达呈负相关，提示p73可能作为抑癌基因，与宫颈鳞癌的发生有关。在宫颈鳞癌组，随着肿瘤分化程度的降低，P73蛋白的阳性表达率有所升高，但不同组织学分化程度之间的差异无显著性，即P73蛋白在宫颈鳞癌组织的表达与组织学分级无关。这与何培芝等[11]的研究结果不符，可能有以下原因：样本量少(鳞癌38例)，若能增大样本，可能进一步增加实验的代表性；免疫组化方法简单，存在一定程度的非特异性染色等。

综上所述，HPV16-E6蛋白在宫颈鳞癌组织中高表达，且与组织学分级密切相关，说明其在宫颈鳞癌的发生、发展中起重要作用，可用于宫颈肿瘤的早期诊断，对于判断宫颈肿瘤的恶性程度及指导治疗也具有一定的价值。

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(本文编辑 厉建强)

EXPRESSIONS OF HPV16 E6 PROTEIN AND P73 IN SQUAMOUS CELL CARCINOMA OF THE CERVIX AND THEIR CORRELATION

LIMin,WANGZhen,LIULei,DONGXianning,WANGGuanqun,LISha

(Department of Gynecology, The Affiliated Hospital of Qingdao University, Qingdao 266003, China)

ObjectiveTo investigate the expressions of human papillomavirus (HPV)16-E6 protein and P73 in tissue of squamous cell carcinoma (SCC) of the cervix and their correlation, and explore their role in the occurence and development of the disease.MethodsTissue of normal cervix was selected from 10 cases, that of cervical intraepithelial neoplasia (CIN) from 22 cases and that of SCC from 38 cases. Employing PowerVision two-step immunohistochemical method to detect the expressions of HPV16-E6 protein and P73 in the three kinds of tissue, and analyze the relationship between both HPV16-E6 protein and P73 and correlated clinical pathologic parameters, as well as the relationship between HPV16-E6 protein and P73.ResultsThe positive rate of HPV16 E6 protein in SCC was higher than that in normal cervix and CIN, the difference was significant (χ2=21.703,P<0.05). In SCC group, the expression of P73 was lower than that in normal and CIN groups, the difference was significant (χ2=15.461,P<0.05). In SCC group, the expression of HPV16-E6 protein was related to histological grade (χ2=9.011,P<0.05), and unrelated to the age of onset, clinical stage, lymph node metastasis and the size of tumor (P>0.05). The expression of HPV16 E6 was negatively correlated with that of P73 (rs=-0.301,P<0.05).ConclusionThe elevation of HPV16-E6 expression is pro-bably correlated with the occurence and progression of squamous cell carcinoma of the cervix. The expression of P73 gradually decreases with the progression of the cancer, indicating that P73 may be a tumor suppressor gene of this malignancy.

uterine cervical neoplasms; cervical intraepithelial neoplasia; human papillomavirus 16; immunohistoche-mistry

2015-02-18;

2015-05-16

李敏(1989-)，女，硕士研究生。

王蓁(1963-)，女，硕士，教授,硕士生导师。

R737.33

A

1008-0341(2015)04-0442-03