张海娟 徐军全 康杰 宋彬妤 王明亮 姚瑞强

·实验研究·

川芎嗪对实验性肝纤维化大鼠肝组织中细胞自噬的影响

张海娟 徐军全 康杰 宋彬妤 王明亮 姚瑞强

目的 研究川芎嗪对肝纤维化时肝组织中细胞自噬的影响及其可能的机制。方法 32只健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组10例、肝纤维化模型组11例、川芎嗪治疗组11例, 以四氯化碳(CCL4)皮下注射复制大鼠肝纤维化模型, 川芎嗪治疗组在复制肝纤维化模型过程中同时给予川芎嗪皮下注射， 对照组给予等体积的植物油代替CCl4, 等体积的生理盐水代替川芎嗪注射液。6周后处死动物, 测定血浆内毒素和肝组织羟脯氨酸、丙二醛(MDA)及LC3B蛋白含量, 免疫组织化学法观测LC3B蛋白在肝组织中的分布情况。结果 肝纤维化时肝组织LC3B的含量明显升高, 主要分布于肝窦周隙细胞, 且LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值与血浆内毒素水平的升高呈正相关；川芎嗪治疗组LC3B表达明显减弱, 尤其是肝窦周隙细胞。结论 川芎嗪的抗肝纤维化作用可能与其降低血浆内毒素、肝星状细胞(HSC)自噬有关。

肝纤维化； 内毒素；自噬；川芎嗪

细胞自噬是当前生物医学界热点研究领域之一, 近年来有不少研究报道提示细胞自噬(autophagy)与肝纤维化之间也存在着密切的关系［1,2］, 干预肝组织中的细胞自噬可能会成为一个新的抗肝纤维化治疗靶点。川芎嗪是从活血化瘀类中药川芎中分离提纯的一种生物碱单体, 实验研究表明川芎嗪具有良好的抗肝纤维化作用［3］, 但其具体作用机制尚不明确。本实验初步观察肝纤维化过程中细胞自噬现象及川芎嗪治疗对自噬的影响, 进一步研究川芎嗪抗肝纤维化的机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性清洁级健康SD大鼠32只, 平均体重(200±20)g, 购买自山西医科大学实验动物中心, 随机分为正常对照组10例、肝纤维化模型组11例、川芎嗪治疗组11例。

1.2 动物模型制备 采用CCl4皮下注射建造大鼠肝纤维化模型, 肝纤维化模型组和川芎嗪治疗组首次皮下注射分析纯CCl45 ml/kg , 之后按3 ml/kg皮下注射40% CCl4植物油(V/V)混合液, 2次/周, 川芎嗪治疗组于造模的同时给予60 mg/kg腹腔注射盐酸川芎嗪注射液, 6次/周, 正常对照组给予等体积的植物油代替CCl4, 等体积的生理盐水代替川芎嗪注射液。

1.3 取材 于造模6周时, 乙醚麻醉大鼠, 无菌无热原技术条件下腹主动脉采血取血浆, 取肝左叶左半部于4%多聚甲醛中固定, 常规石蜡包埋4 μm切片；其余部分液于-86℃冰箱保存备用。

1.4 主要试剂与方法 兔源LC3B多克隆抗体, 购自美国SIGAM公司(批号L7543), 二抗为羊抗兔抗体, 购自北京中杉金桥有限公司, β-actin一抗及二抗均购自北京中杉金桥有限公司。显色基质偶氮法鲎试剂盒购自厦门市鲎试剂实验厂有限公司, 天狼猩红、固绿购自Sigma公司, MDA试剂盒购自南京建成生物工程研究所；盐酸川芎嗪注射液购自郑州卓峰制药有限公司。肝组织胶原染色及羟脯氨酸(HYP)含量测定参照本实验室以往的方法［3］；血浆内毒素及肝组织MDA含量测定依照试剂盒说明书操作；Western Blot测定组织LC3B蛋白的表达。

1.5 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示, 采用t检验；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。相关性分析采用Pearson法。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 LC3B免疫组织化学染色显示 正常对照组大鼠的肝组织仅有少量的LC3B表达；肝纤维化模型组大鼠肝细胞胞浆及胞核中LC3B表达阳性颗粒表达显著增加, 主要分布于肝窦周隙细胞；川芎嗪治疗组较肝纤维化模型组肝细胞胞浆及胞核中LC3B的阳性颗粒明显减少, 差异均具有统计学意义(P＜0.05)。

2.2 血浆内毒素含量及肝损伤、肝纤维化指标 肝纤维化模型组血浆内毒素及肝组织中HYP、MDA的含量均较正常对照组明显升高(P＜0.01), 而川芎嗪治疗组均明显降低, 形态学观察与胶原染色也明显改善。见表1。

2.3 LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值的变化 正常对照组LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ的比值最低, 肝纤维化模型组随着内毒素浓度的增加, LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值逐渐增高, 川芎嗪治疗组LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ的比值较肝纤维化组低, 但仍明显高于正常对照组(P＜0.05)。见表1。血浆内毒素与肝组织LC3B-Ⅱ/ LC3B-Ⅰ表达呈正相关(r=0.87, P＜0.05)。

表1 各组大鼠血浆内毒素(ET)和肝组织HYP、 MDA、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值的比较

表1 各组大鼠血浆内毒素(ET)和肝组织HYP、 MDA、LC3B-Ⅱ/LC3B-Ⅰ比值的比较

注： 与正常对照组比较,aP＜0.01,bP＜0.05；与肝纤维化模型组比较,cP＜0.01,dP＜0.05

组别例数ETHYPMDALC3BⅡ/Ⅰ正常对照组100.22±0.040.08±0.15 2.31±0.571.02±0.32肝纤维化模型组11 0.78±0.29a0.35±0.19a14.86±2.11a1.93±0.27川芎嗪治疗组11 0.41±0.08b0.19±0.09c4.86±0.95c1.53±0.14d

3 讨论

近年来, 肝纤维化的研究日益深入, 许多观念得到更新,但HSC的活化仍然是公认的关键环节［4］。实验证明, HSC的活化过程与细胞自噬的发生有关, 细胞自噬可促进HSC的活化, 进而促进肝纤维化［1,2］。细胞自噬是一种降解细胞内的长寿蛋白质和受损的细胞器维持细胞内平衡的代谢过程。LC3B蛋白是常用的细胞自噬的标志分子, 有Ⅰ、Ⅱ型之分,未发生自噬时, 细胞内合成的LC3B先成为胞浆可溶性的LC3B-Ⅰ；当细胞自噬发生时, LC3B-Ⅰ经加工修饰与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺结合形成LC3B-Ⅱ。其含量与自噬泡数量成正比, LC3B-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值可估计自噬水平的高低。

川芎嗪在治疗肝纤维化中取得了较好的效果, 以往认为其主要机制和抗脂质过氧化、抗肝细胞损伤有关, 本室最近的研究也表明可能与其降低内毒素血症, 激活肝内Nrf2/ARE抗氧化通路有关［3］。各种急慢性肝脏疾病常伴有肠源性内毒素血症可促进肝纤维化的发生与发展, 但其机制尚不完全清楚。最新资料提示, 内毒素可通过TLR4信号通路诱导腹膜腔间皮细胞自噬［5］, 由此推测内毒素也可能通过TLR4信号通路诱导HSC自噬进而促进肝纤维化, 川芎嗪的抗纤维化作用也可能与其降低血浆内毒素进而降低HSC自噬有关。本实验结果显示, 川芎嗪在抗纤维化、降低血浆内毒素的同时,肝组织细胞自噬也明显减轻, 而且LC3B-Ⅱ/Ⅰ与血浆内毒素水平呈明显的正相关。

综上所述, 川芎嗪的抗肝纤维化作用可能与其降低血浆内毒素、肝星状细胞自噬现象有关。进一步的因果关系及其机制有待下一步的离体细胞培养实验证实。

［1］ Song, Y, Zhao, Y, Wang, F.et al.Autophagy in hepatic fibrosis.Biomed Res Int, 2014:436-442.

［2］ Hernandez-Gea, V, Friedman, S L.Autophagy fuels tissue fibrogenesis.Autophagy, 2012, 8(5):849-850.

［3］ 戚红丹.川芎嗪对大鼠肝纤维化胶原干预及肝细胞基因谱影响的研究.北京中医药大学, 2007.

［4］ Puche, J E, Saiman, Y, Friedman, SL.Hepatic stellate cells and liver fibrosis.Compr Physiol, 2013, 3(4):1473-1492.

［5］ Wang, J, Feng, X, Zeng, Y, et al.Lipopolysaccharide (LPS)-induced autophagy is involved in the restriction of Escherichia coli in peritoneal mesothelial cells.BMC Microbiol, 2013(13):255.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.18.191

2015-03-20］

030001 山西医科大学(张海娟)；山西医科大学汾阳学院(徐军全 康杰 宋彬妤 姚瑞强 王明亮)

徐军全