张连娣 梁学林

消支饮治疗小鼠生殖道解脲支原体感染对血清干扰素-γ的影响

张连娣 梁学林

建立小鼠生殖道解脲支原体(Uu)感染的动物模型, 观察中药复方“消支饮”治疗小鼠生殖道Uu感染对小鼠血清中干扰素-γ(IFN-γ)的影响, 探讨“消支饮”的疗效机制。

生殖道解脲支原体感染；消支饮；小鼠；干扰素-γ

解脲支原体(Uu)是介于细菌与病毒之间的最小原核微生物, 属于柔膜体纲、支原体科、脲原体属的微生物。主要寄生在人类泌尿生殖道黏膜表面, 女性生殖道感染后可上行至子宫腔和输卵管腔引起相应部位的炎症。针对其病因病机导师梁学林教授制定了以健脾益气, 升阳除湿为主, 佐以清热解毒杀虫的治疗大法, 自拟“消支饮”方治疗本病, 注重扶正祛邪, 固护正气, 尤其对抗生素治疗耐药的患者更为适宜。通过动物实验以中药“消支饮”方, 治疗Uu感染, 并设西药“阿奇霉素”为对照组, 从小鼠Uu转阴率、血清干扰素-γ两方面观察“消支饮”的治疗作用。

1 材料与试剂

1.1 实验动物 BALB/C小鼠104只购于中国医学科学院实验动物研究所, 鼠龄8周, 雌性, 清洁级, 体重(20±2)g。

1.2 实验药品及制备 消支饮：由太子参、山药、柴胡、炙甘草、陈皮、白芍、炒荆芥、车前子、苍术、炒白术、黄柏、苦参等中草药组成, 由辽宁中医药大学附属医院中药局制备,浓缩至2 g/ml(即1 ml煎液内含有2 g生药), 灭菌备用。

阿奇霉素：石家庄欧意药业有限公司生产, 规格：0.25 g/片,生产批号：国药准字H10980218。

1.3 主要试剂 Uu标准株：Uu血清8型冻干标准株, 由南华大学微生物教研室提供。复苏并传代后备用。

液体培养基：购于珠海丽珠试剂有限公司, 批号：YZB/粤0205-2007。

固体培养基：购于上海恩康生物科技有限公司, 批号：YZB/沪0948-40-2005。

小鼠IFN-γ定量酶联检测试剂盒：购于ADLITTERAM DIAGNOSTIC LABORATORIES, 批号：QRCT-301330101003-EIA/UTL。

1.4 主要仪器及设备 酶联免疫吸收分析仪, 型号Anthos-2010, 用于测定血清IFN-γ；日本奥林巴斯BX51号显微镜,用于小鼠阴道分泌物Uu检测观察。

2 实验方法

2.1 Uu菌液制备 将冻于-80℃的Uu血清8型标准株置37～45℃水浴中1 min, 使其快速融化, 无菌接种于Uu液体培养基, 37℃恒温箱培养24～48 h, 见液体培养基由黄变红, 且液体澄清透亮无浑浊、沉淀, 可确认有Uu生长。取对数生长期Uu菌液制成2.5×105ccu/ml浓度, 经1000 r/min 4℃离心集菌备用。

2.2 动物造模 在同样条件下, 随机分为A、B、C、D、E、F、G 7组。模拟Taylor-Robinson的造模方法, A、B、C、D、E、F组每只小鼠颈部皮下注射苯甲酸雌二醇0.4 mg, 浓度1 mg/ml, 每周1次, 共4次。A、B、C、D、E、F组小鼠在经过雌激素预处理后, 将血清8型浓度为2.5×105cuu/ml的Uu菌液用留滞针软管取20 μl注入小鼠阴道, 连续给菌3 d。小鼠在接种Uu 1周后取小鼠阴道分泌物进行检测。用2支无菌棉签棒伸入小鼠阴道0.5 cm轻轻转动, 将第1支棉签在液体培养基(1 ml)中充分洗脱, 进行液体培养；第2支棉签接种于Uu固体培养基平板上。固体和液体培养基均放于37℃孵育箱孵育, 24～48 h后观察结果, 液体培养基颜色由黄变红且澄清, 固体培养基长出典型“煎蛋样”Uu菌落, 提示造模成功。

2.3 分组给药治疗 消支饮预防高剂量组(A组：14只小鼠,造模同时, 给予中药“消支饮”80 g/(kg·d), 连续给药4周；消支饮预防低剂量组(B组)：14只小鼠, 造模同时, 给予中药“消支饮”20 g/(kg·d), 连续给药4周；消支饮治疗高剂量组(C组)：17只小鼠, 造模成功后, 给予中药“消支饮”80 g/(kg·d), 连续给药3周；消支饮治疗低剂量组(D组)：17只小鼠, 造模成功后, 给予中药“消支饮”20 g/(kg·d), 连续给药3周；阿奇霉素组(E组)：14只小鼠, 造模成功后,给予西药“阿奇霉素”0.2 g/(kg·d), 连续给药2周；模型组(F组)：16只小鼠, 造模成功后, 给予0.9%的生理盐水, 连续3周；空白组(G组)：12只小鼠, 正常饲养, 与模型组同时给予0.9%的生理盐水, 连续3周；灌胃量：每10 g小鼠给0.4 ml的药液, 每天给药1次。

2.4 实验检测指标 小鼠转阴率的检测：实验给药结束后,全部小鼠取阴道分泌物进行检测。24～48 h后观察结果。于奥林巴斯BX51号显微镜下观察并拍照。

小鼠血清中IFN-γ值检测：用消毒眼科镊取出小鼠眼球, 取小鼠眼球血, 应用酶联免疫吸收分析仪检测血清IFN-γ值。

2.5 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行统计分析。计数资料采用率(%)表示, 行χ2检验；计量资料应用LSD-t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

小鼠在接种Uu 1周后取小鼠阴道分泌物进行检测。液体及固体培养基检测结果显示：A、B、C、D、E、F组小鼠均感染了Uu, 感染率100%, 空白组12只小鼠均未感染Uu,感染率0。证明实验造模成功。

3.1 治疗后Uu转阴率 各组小鼠治疗4周后对小鼠分泌物Uu检测结果, 见表1。

表1 各组治疗后Uu转阴率的比较(n, %)

3.2 血清IFN-γ检测 取小鼠眼球血, 离心分离出血清,采用酶联免疫吸附法, 由酶联免疫吸收分析仪读取结果, 换算出最后IFN-γ值。基本步骤①取出酶标板, 依照次序对应分别加入100 μl的标准品于空白微孔中；②分别标记样品编号, 加入100 μl 样品于空白微孔中；③在标准品孔和样品孔中加入50 μl的酶标记溶液；④(36±2)℃孵育反应60 min；⑤洗板机清洗5次, 每次静置10～20 s；⑥每孔加入底物A、B液(呈色剂)各50 μl；⑦(36±2)℃下避光孵育反应15 min；⑧每孔加入50 μl终止液, 终止反应。

结果判断：于波长450 nm的酶标仪上读取各孔的OD值；B=标准品OD值、B0=标准品0点OD值；以B/B0%值为纵坐标, 以标准品的浓度为横坐标, 在对数坐标纸上绘制标准曲线；在标准曲线上查找对应的浓度范围；敏感度为1.0 pg/ml, 根据样品OD值在该曲线图上查出相应小鼠IFN-γ含量。应用LSD-t检验方法统计各组小鼠血清中IFN-γ值,见表2。

表2 各组小鼠血清中IFN-γ值

表2 各组小鼠血清中IFN-γ值

注：与模型组比较,aP＜0.05；与阿奇霉素组比较,bP＜0.05

组别例数IFN-γ值(pg/ml)消支饮预防高剂量组529.5410±17.1234消支饮预防低剂量组622.5202±10.8519ab消支饮治疗高剂量组1433.4491±6.9497消支饮治疗低剂量组1338.0744±18.7311阿奇霉素组1436.1215±14.3131模型组1140.5749±22.6526空白组1229.4369±12.5943

4 讨论

4.1 本实验研究的结果分析

4.1.1 治疗后转阴率分析 各组小鼠治疗4周后对小鼠分泌物Uu检测结果说明, 消支饮和阿奇霉素对Uu感染均有治疗作用。本实验属于急性Uu感染, 根据转阴率可以说明, 阿奇霉素对急性Uu感染的抑菌作用优于消支饮, 且消支饮高剂量组疗效优于低剂量组。

4.1.2 干扰素-γ值分析 国内外专家研究发现Uu发病与免疫因素有关, 其中IFN-γ由活化的T细胞产生, 是迟发型超敏反应(DHSR)中最重要的细胞因子, 多位学者认为, 在Uu感染致病过程中与输卵管损伤有关。Shcheglovitova等［1］发现Uu感染妇女血清IFN-γ水平升高。袁淑珍［2］通过研究发现输卵管支原体感染不孕妇女输卵管液中IFN-γ水平升高,认为支原体感染引起的输卵管炎症导致不孕可能与IFN-γ升高有关。IFN-γ作为免疫细胞因子, 在正常情况下, 对机体有保护作用；如其过度表达, 则引起免疫损伤。韩延华等［3］用80只小鼠做Uu感染后血清IFN-γ的动物实验研究, 通过自拟方剂消抗灵Ⅱ号和阿奇霉素治疗, 结果发现消抗灵Ⅱ号和阿奇霉素均能降低Uu感染引起的血清IFN-γ的水平升高, 说明通过治疗与防治, 可能影响Uu感染引起的血清IFN-γ的高水平。

本实验采用酶联免疫吸附法, 检测各组小鼠血清中IFN-γ值, 应用LSD-t检验方法统计结果表明：小鼠感染Uu后, IFN-γ值有上升趋势。用药治疗后：①各组与模型组比较, 其中消支饮预防低剂量组与模型组比较, 差异有统计学意义(P＜0.05), 说明消支饮能降低Uu感染引起的IFN-γ高水平。②各组与阿奇霉素组比较, 其中消支饮预防低剂量组与阿奇霉素组比较, 差异有统计学意义(P＜0.05), 说明消支饮较阿奇霉素更能降低Uu感染引起的IFN-γ高水平。

通过本次实验研究, 可以看出消支饮是治疗Uu感染的有效方剂。该方不仅能有效改善Uu感染引起的生殖道组织炎症, 且能降低Uu感染引起的IFN-γ高水平, 能整体调节机体的免疫功能, 与现代研究认为Uu致病与免疫因素有关是相一致的。而且这为中医药治疗Uu感染开辟了新途径,提供了理论依据。

［1］ Shcheglovitova ON, Maksianina EN, Rastegaeva IN, et al.Status of interferon in genital infections.Vopr Virusol, 2001, 46(2):36.

［2］ 袁淑珍.输卵管支原体感染不孕妇女输卵管液中TNF-α、IFN-γ和IL-6的水平.医学临床研究, 2006, 23(5):707-708.

［3］ 韩延华, 辛雪艳.消抗灵Ⅱ号对小鼠解脲支原体感染及感染后血清中干扰素-γ的影响.世界中西医结合杂志, 2008, 3(2): 83-85.

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.13.210

2015-02-09］

123000 阜新市第二人民医院(妇产医院)中医妇科(张连娣)；辽宁中医药大学附属医院中医妇科(梁学林)