张东涛 黄伟哲 陈喜珊

·实验研究·

丹参水提物通过调节PI3K/Akt信号通路来抑制急性心肌缺氧缺血的伤害

张东涛 黄伟哲 陈喜珊

评估丹参水提物对急性心肌缺氧缺血的作用, 为临床应用提供一定实验依据。建立大鼠急性心肌缺氧再灌注模型, 丹参水提物在模型建立前饲喂大鼠, 结果表明丹参水提物可明显降低心肌缺氧大鼠的氧化伤害, 提高Akt蛋白的磷酸化和bcl-2/bax, 最终减轻心肌细胞的凋亡。作者认为丹参水提物通过激活PI3K/Akt信号通路进而调节下游凋亡蛋白从而发挥对急性心肌缺氧缺血的明显保护作用。

心肌缺氧再灌注;丹参水提物;大鼠

丹参是唇形科植物丹参的干燥根和根茎。丹参是著名的传统中药, 具有抗氧化、改善微循环、防止血栓形成等多种功效［1］。丹参对心、肝、肺、脑等多种组织器官的缺血再灌注损伤具有明显作用, 主要通过以下途径：清除氧自由基,保护线粒体, 改善能量代谢［2,3］。本文通过丹参水提物处理心肌缺血再灌注大鼠来研究其心肌保护功能和机理。

1 材料与方法

1.1 材料 60只SD大鼠, 2月龄, 购自上海斯莱克实验动物有限公司。丹参水提物为本试验室制备。

1.2 方法

1.2.1 动物分组及动物模型 60只大鼠分为五组, 每组12只。 I/R组：所有大鼠均采用全身麻醉, 以 3% 戊巴比妥钠(1.5 ml/kg) 腹腔注射(i.p.) 麻醉, 并行气管切开插管, 连接于小型动物呼吸机, 调节呼吸频率为80～90次/min, 开胸暴露心脏,行心房插管, 并引流至储血槽, 并向储血槽内吹入100%纯氧, 同时暴露股动脉, 行股动脉插管, 通过蠕动泵引流储血槽内氧和血通过股动脉泵入体循环。体外循环建立后, 即用动脉夹行升主动脉阻断。然后观察心电图 S-T 段变化, 阻断30 min 后, 开放升主动脉。再灌注 2 h后, 断头取血并采集心脏。用于心肌梗死面积测定的大鼠心肌样本在再灌注24 h后取下心脏。假手术组(sham)的所有大鼠不阻断升主动脉。丹参水提物组(150或300 mg/kg)：在手术前15 d, 鼠被灌喂150或300 mg/kg的丹参水提物, 其余同I/R组。LY294002组:在再灌注前15 min, 鼠被给LY294002(0.3 mg/kg i.v.)(经尾静脉给药), 其余同I/R组。

1.2.2 MDA和抗氧化酶活力测试 按照上海广锐生物科技有限公司的试剂盒说明书的要求进行丙二醛(MDA)和抗氧化酶活力的测定。

1.2.3 凋亡率(AI)测定 AI按文献[4]的方法测定。

1.2.4 心肌组织匀浆中的bax、bcl-2、Akt、p-Akt的Western印迹法检测 大鼠取心组织, 提取蛋白, 应用Western印迹法进行检测分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件进行数据统计分析。计量资料以均数±标准差表示, 采用t检验；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 大鼠心肌缺血后再灌注120 min后, I/R组大鼠MDA水平增加显著而抗氧化酶活力显著下降, 和假手术组比较差异有统计学意义(P＜0.01), 丹参水提物低剂量组和高剂量组与I/ R组相比较MDA水平降低和抗氧化酶活力上升幅度差异有统计学意义(P＜0.01), 与I/R组相比较, LY294002能够显著降低丹参水提物对鼠心肌中氧化伤害的效果。见表1。

2.2 大鼠心肌缺血后再灌注120 min后, I/R组大鼠bax、AI水平增加显著而bcl-2、bcl-2/bax水平显著下降, 和假手术组比较差异有统计学意义(P＜0.01), 丹参水提物低剂量组和高剂量组与I/R组相比较bax、AI水平降低和bcl-2、bcl-2/bax上升幅度差异有统计学意义(P＜0.01), LY294002可以减弱丹参水提物对鼠心肌凋亡蛋白的影响。见表2。

2.3 大鼠心肌缺血后再灌注120 min后, I/R组大鼠p-Akt水平增加, 和假手术组比较差异有统计学意义(P＜0.01), 丹参水提物低剂量组和高剂量组与I/R组相比较p-Akt水平降低幅度差异有统计学意义(P＜0.01), LY294002能够减低丹参水提物对鼠心肌p-Akt水平的提高, 各组鼠心肌Akt水平比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表3。

表1 各组鼠心肌中MDA水平和抗氧化酶活力比较

表1 各组鼠心肌中MDA水平和抗氧化酶活力比较

注：与假手术组比较,aP＜0.01；与I/R组比较,bP＜0.01

组别例数MDA超氧化物歧化酶CAT谷胱甘肽过氧化物酶假手术组122.13±0.28197.48±20.1481.39±9.56121.52±10.62 I/R组12 8.45±0.71a84.09±7.99a36.01±4.04a58.49±6.59a丹参水提物低剂量组12 6.27±0.54b137.11±11.35b55.36±6.38b 91.36±10.72b丹参水提物高剂量组12 3.66±0.31b178.38±15.24b73.52±7.77b131.75±14.38bLY294002组12 5.83±0.48b 149.5±13.32b48.24±5.49b86.47±9.11b

表2 各组鼠心肌中bax、bcl-2、bcl-2/bax水平和AI

表2 各组鼠心肌中bax、bcl-2、bcl-2/bax水平和AI

注：与假手术组比较,aP＜0.01；与I/R模型组比较,bP＜0.05,cP＜0.01

组别例数baxBcl-2Bcl-2/baxAI (%)假手术组120.21±0.020.66±0.073.14±0.29 9.54±0.85 I/R组12 0.73±0.06a0.28±0.03a0.38±0.04a89.45±7.88a丹参水提物低剂量组12 0.59±0.06b0.49±0.06c0.83±0.07c60.24±6.63c丹参水提物高剂量组12 0.43±0.25c0.63±0.05c1.47±0.16c24.72±3.06cLY294002组12 0.61±0.05c0.46±0.05c0.75±0.09c72.18±3.11c

表3 各组鼠心肌中p-Akt、Akt水平

表3 各组鼠心肌中p-Akt、Akt水平

注：与假手术组比较,aP＜0.01；与I/R 组比较,bP＜0.01

组别例数p-AktAkt假手术组120.94±0.090.58±0.06 I/R组12 0.15±0.01a0.61±0.07丹参水提物低剂量组12 0.41±0.05b0.59±0.05丹参水提物高剂量组12 0.88±0.07b0.63±0.07 LY294002组12 0.61±0.06b0.58±0.06

3 讨论

心肌缺血再灌注损伤是缺血损伤的延续和扩大, 是彼此独立而相互联系的病理生理过程。因此, 尽快解除机体缺血状况, 对减轻因缺血造成的损伤性变化有着重要的临床意义。合理应用抗再灌注损伤药物, 将大大降低再灌注损伤带来的危害, 增强心肌细胞抗再灌注损伤的能力, 对缺血心肌具有一定的保护作用［5,6］。在心肌缺血再灌注开始前, 产生过多的活性氧自由基(ROS)是心肌缺血再灌注损伤发病机制的重要的环节。在再灌注开始的时间内, 通过有效清除大量的ROS、减轻ROS的细胞毒性损伤, 对于减轻心肌缺血再灌注损伤具有重要意义。PI3K/Akt信号通路可以影响其他信号通路的活性, 例如MAPK Erk1/2 信号通路［7］, 从而影响细胞的生物特性。本实验发现, 丹参水提物能够提高磷酸化Akt的表达, 同时提高bcl-2/bax的水平, 降低心肌细胞凋亡指数,这一结果与Akt抑制剂LY294002的效果是一致的。这表明丹参水提物是通过激活PI3K/Akt信号通路进而抑止下游的凋亡基因和清除自由基来实现降低心肌缺血再灌注诱导的伤害的。

［1］ Qin R, Lin J, Li C, et al.Study of the protective mechanisms of Compound Danshen Tablet (Fufang Danshen Pian) against myocardial ischemia/reperfusion injury via the Akt-eNOS signaling pathway in rats.J Ethnopharmacol, 2014(156):190-198.

［2］ Xiao Y, Qing W, Lan M, et al.Sodium tanshinone IIA sulfonate derived from Slavia miltiorrhiza Bunge up-regulate the expression of prolactin releasing peptide (PrRP) in the medulla oblongata in ovariectomized rats.Biochem Pharmacol, 2006, 72(5):582-587.

［3］ Dai H, Li X, Li X, et al.Coexisted components of Salvia miltiorrhiza enhance intestinal absorption of cryptotanshinone via inhibition of the intestinal P-gp. Phytomedicine, 2012, 19(14):1256-1262.

［4］ Lin C, Sui H, Gu J, et al.Effect and mechanism of propofol on myocardial ischemia reperfusion injury in type 2 diabetic rats.Microvasc Res, 2013(90):162-168..

［5］ Zhou H, Hou S, Luo P, et al.Ginseng protects rodent hearts from acute myocardial ischemia-reperfusion injury through GR/ ER-activated RISK pathway in an endothelial NOS-dependent mechanism.J Ethnopharmacol, 2011, 135(2):287-298.

［6］ Ding H, Zhu H, Dong J, et al.Intermittent hypoxia protects the rat heart against ischemia/reperfusion injury by activating protein kinase C.Life Sci, 2004, 75(21):2587-2603.

［7］ Zhu M, Du M, Hess B, et al.Periconceptional nutrient restriction in the ewe alters MAPK/ERK1/2 and PI3K/Akt growth signaling pathways and vascularity in the placentome.Placenta, 2007, 28(11-12):1192-1199.

Salvia miltiorrhiza aqueous extract in suppression of damage from acute myocardial hypoxia and ischemia through regulation of PI3K/Akt signal pathway

ZHANG Dong-tao, HUANG Wei-zhe, CHEN Xi-shan.Department of Cardiovascular Medicine, The First Affiliated Hospital of Medical College of Shantou University, Shantou 515041, China

An evaluation was made on the effect by salvia miltiorrhiza aqueous extract for acute myocardial hypoxia and ischemia, in order to provide experimental reference for clinical application.Myocardial ischemia reperfusion model of rat was established, and salvia miltiorrhiza aqueous extract was given to rat for feed before model establishment.The results showed that salvia miltiorrhiza aqueous extract could obviously reduce oxidative damage in myocardial hypoxia rat.It could increase phosphorylation of Akt protein and bcl-2/bax, in order to reduce apoptosis of cardiac muscle cell.It could be concluded that salvia miltiorrhiza aqueous extract showed remarkably protective effect for acute myocardial hypoxia and ischemia by activating PI3K/Akt signal pathway for regulation downstream apoptin.

Myocardial ischemia reperfusion; Salvia miltiorrhiza aqueous extract; Rat

10.14163/j.cnki.11-5547/r.2015.13.209

2014-12-05］

515041 汕头大学医学院第一附属医院心血管内科(张东涛), 心胸外科(黄伟哲)；汕头大学医学院第二附属医院心血管外科(陈喜珊)