李敏杰，熊亚，韩洪波

（1.攀枝花学院生物与化学工程学院，四川攀枝花617000；2.攀枝花市干热河谷特色生物资源工程技术中心，四川攀枝花617000）

红心果，又名番石榴、芭乐、鸡屎果。成熟时淡黄或粉红色，因其果肉呈红色而得名，肉质鲜嫩、绵软香甜，味略酸，气味浓烈，有助消化。红心果是一种适应性很强的热带野生果树，在攀枝花山区分布较广，果实富含维生素，特别是VC，含有大量的氨基酸及微量元素如铁、钾、胡萝卜素等[1]，其根、茎、叶均可作药用，已有关于从红心果叶提取多糖、多酚[2-3]，讨论其药理作用的研究报道[4]，因此红心果果树全身都是宝，具有潜在的市场开发价值。近年来，对红心果的研究越来越多，主要集中在其果实的加工方面，如红心果茶酒[5]、醋饮料[6]、果脯[7]、果条[8]、果冻[9]、复合饮料[10-11]等方面，杨胜远等[12]利用正交试验探讨了红心果果酒的酿制条件，得到了酿造过程中酒曲添加量、温度、初始pH及加糖量的最佳参数，李敏杰等[13]利用正交设计，从发酵温度、SO2添加量及酵母菌添加量3个方面探讨了红心果果酒发酵的最佳条件。利用响应面进行红心果果酒发酵工艺优化的研究少见有报道。响应面分析法[14]作为实验设计及统计的一种基本方法，在生物学中应用相当广泛，是生物学中的一种重要优化方法，主要用于确定各种工艺或培养实验的最优条件。

本试验以红心果果酒发酵过程中的酒精度为响应值，采用单因素试验和响应面分析法对红心果果酒的发酵条件进行优化，为今后进行红心果果酒工厂化生产提供一定的参考。

1 材料及方法

1.1 材料与仪器

野生红心果：采自四川省攀枝花市仁和区大田乡；酵母（安琪高活性酵母）：湖北宜昌安琪酵母股份有限公司；亚硫酸（99.8%）：成都科龙化工试剂厂。

10609CHO手持折光仪：郑州南北仪器设备公司；BL610电子天平：上海静天电子仪器有限公司；BM255果汁机：美的集团有限公司。

1.2 方法

1.2.1 试验流程

[13]中的试验流程。

1.2.2 单因素试验

在本试验中，选用发酵温度、SO2添加量及酵母菌接种量3个因素，按照发酵温度分别为20、22、24、26、28℃，二氧化硫添加量分别为40、50、60、70、80、90mg/kg，接种体积分数分别为3%、4%、5%、6%、7%的酵母菌进行红心果果酒发酵，发酵完毕测定酒精度。

1.2.3 响应面试验

选定二氧化硫添加量（X1）、酵母接种量（X2）和发酵温度（X3）为自变量，酒精度（Y）为响应值，利用软件SAS 9.2进行响应面分析，确定所选各因素对果酒发酵酒精度的影响，得到最优参数。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 二氧化硫添加量对红心果果酒酒精度的影响

图1表明二氧化硫添加量对酒精度的影响。

图1 二氧化硫添加量对酒精度的影响Fig.1 Effect of SO2amount on alcoholic strength

在SO2添加量从40 mg/kg增加到70 mg/kg时，酒精度值也随着增加，在添加量为70 mg/kg时，酒精度值达到最大，为9.2%。当二氧化硫添加量继续增加时，酒精度值不再升高，反而有所下降，二氧化硫添加量过高，可在一定程度上抑制酵母菌的发酵活性，势必会影响到果酒发酵的酒精度。故二氧化硫添加量控制在70 mg/kg较为合适。

2.1.2 酵母菌接种量对红心果果酒酒精度的影响

图2表明接种量对酒精度的影响。

图2 酵母菌接种量对酒精度的影响Fig.2 Effect of inoculation amount of yeast on alcoholic strength

图2表明，在酵母菌接种量从4%到6%时，酒精度一直呈上升趋势，由此可见，接种量在6%时，酒精度达到最大值，为9.5%。随着接种量的继续增加，酒精度反而开始下降，这可能是因为酵母菌接种量过大，其生长代谢衰亡期提前，对发酵造成影响。因此，选择6%的酵母菌接种量比较合适。

2.1.3 发酵温度对红心果果酒酒精度的影响

图3表明发酵温度对酒精度的影响。

图3 发酵温度对酒精度的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on alcoholic strength

图3表明，发酵温度从22℃到26℃，酒精度不断上升，在26℃的时候达到最大值。温度的高低，会影响酵母菌的生长，其发酵活性也会受到影响。因此，我们将温度控制在26℃。

2.2 响应面分析

2.2.1 选取响应面分析的因素及水平

根据单因素试验结果，进行三因素三水平的响应面试验分析。表1表明响应面分析因素与水平的选取值。

表1 响应面分析因素与水平Table 1 Analytical factors and levels for RSA

2.2.2 响应面试验方案及结果

表2表明响应面试验方案及试验结果。

表3表明响应面分析的结果。

对三个因素作如下变换：X1=（A-70）/10，X2=（B-6）/1，X3=（C-24）/2。以此三个因素作为自变量，酒精度（Y）为响应值，采用SAS 9.2软件进行统计分析（表2）。

表2 响应面试验方案及试验结果Table 2 Program and results of RSA

表3 回归分析结果Table 3 Results of regression analysis

经回归拟合，建立数学模型：

Y=8.5+0.037 5X1+0.087 5X2+0.225X3-0.125X1X1-0.075X1X3-0.125X2X2-0.025X2X3-0.2X3X3。式中：Y为酒精度，%；X1为 SO2添加量，mg/kg；X2为酵母菌接种量，%；X3为发酵温度，℃。

根据数学模型，对 X1、X2、X3求偏导，带入各因素的变换方程中求得SO2添加量即A=51.3 mg/kg，酵母菌接种量即B=5.33%，发酵温度即C=24.98℃。在此优化条件下，红心果果酒发酵酒精度的理论值为9.58%。

表3表明，模型达到显著水平，说明试验设计可靠，拟合的二次回归方程合适，据此可以看出，该回归模型可用来预测响应值酒精度（Y）的具体情况。由回归方程中的各项系数所具有的显著性可知，因素X2对酒精度（Y）具有显著的影响效应，因素X3对酒精度（Y）具有极显著的影响，且均为正效应；而因素X1对酒精度（Y）不具有显著的影响；二次项因素中X3X3对酒精度（Y）具有极显著的影响，而X1X1、X2X2对酒精度（Y）具有显著影响；交互式因素 X1X2、X1X3、X2X3对酒精度（Y）不具有显著影响，因此各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。

2.2.3 红心果果酒发酵工艺的响应面及等高线图

通过响应面图形可以直观的观察到试验设计的最优组合，对最佳参数及各参数之间的相互作用也一目了然[15]，响应值会受到各因素或其交互作用的影响，其影响效果可以通过等高图来体现[16]。响应面分析及等高线图见图4～图6。

图4表明SO2添加量及酵母菌接种量对酒精度的响应面及等高线图。

图4 SO2添加量及酵母菌接种量对酒精度的响应面及等高线图Fig.4 Responsive surfaces and counter of SO2amount and yeast inoculation amount.

图5表明SO2添加量及发酵温度对酒精度的响应面及等高线图。

图6表明发酵温度及酵母菌添加量对酒精度的响应面及等高线图。

2.2.4 验证试验

为验证响应面法所得结果的可靠性，在上述响应面分析法求得的最佳条件下重复发酵3次，实际测的的平均酒精度为9.61%，与模型预测值9.58%基本一致，可见模型能较好地预测实际发酵酒精度的情况，适合于此发酵工艺，因此，基于响应面优化的发酵工艺参数可靠，具有实用价值。

图5 SO2添加量及发酵温度对酒精度的响应面及等高线图Fig.5 Responsive surfaces and counter of SO2amount and fermentation temperature

图6 发酵温度及酵母菌添加量对酒精度的响应面及等高线图Fig.6 Responsive surfaces and counter of fermentation temperature and inoculation amount of yeast

3 结论

通过单因素试验，二氧化硫添加量控制在70 mg/kg比较好，酵母菌接种量控制在6%比较好，发酵温度则控制在26℃较好，酒精度值最高。在此基础上再利用响应面分析法对红心果果酒发酵的工艺条件进行了研究，考察了二氧化硫添加量、酵母菌接种量和发酵温度3个因素对酒精度的影响，得到最佳参数为二氧化硫添加量A为51.3mg/kg，酵母菌接种量B为5.33%，发酵温度C为24.98℃。在此发酵工艺条件下野生红心果果酒酒精度的理论值为9.58%。通过验证试验，在此优化条件下的实际平均酒精度为9.61%。由此可见，通过响应面法得到的红心果果酒发酵条件参数准确可靠，实际工艺可以以此作为借鉴。果酒发酵工艺是一种成熟的工艺，响应面法目前来说可以很好地用于发酵工艺最佳参数的确定，但它不是唯一方法，在今后的类似分析中，应该尽可能的使用多种统计方法对数据进行分析处理，才能使最终的结果更为准确和可靠。

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