王寒冬,刘 静,刘 露,向春蓉,李 天,杨泽身,丁春邦,*

(1.四川农业大学 生命科学学院,四川雅安 625014;2.四川农业大学 农学院,四川成都 611130;3.凉山州中泽新技术开发有限责任公司,四川西昌 615000)

微波辅助提取油橄榄多酚及抗氧化活性研究

王寒冬1,刘 静1,刘 露1,向春蓉1,李 天2,杨泽身3,丁春邦1,*

(1.四川农业大学 生命科学学院,四川雅安 625014;2.四川农业大学 农学院,四川成都 611130;3.凉山州中泽新技术开发有限责任公司,四川西昌 615000)

以油橄榄鲜果为实验材料,采用响应面法优化微波辅助提取油橄榄多酚的工艺,并分析多酚提取液的抗氧化活性。在单因素实验的基础上,根据Box-Benhnken实验设计原理建立二次回归模型,确定最佳提取工艺条件为料液比1∶23(g/mL)、微波时间48 s、微波功率490 W,油橄榄多酚实际平均得率为6.9659 mg/g,与预测值的相对误差为1.12%。油橄榄多酚提取液对DPPH自由基和羟基自由基的最大清除率分别为87.85%、68.12%,其IC50分别为0.055、0.188 mg/mL,对Cu2+的最大螯合率为54.18%,半螯合浓度为0.277 mg/mL。

油橄榄,多酚,响应面法,微波辅助提取,抗氧化性

油橄榄(OleaeuropaeaL.)是木犀科木犀榄属亚热带常绿乔木,又名洋橄榄、齐墩果,与油棕、油茶和椰子并称为世界四大木本油料作物,盛产于地中海地区。我国自20世纪60年代开始陆续引种,目前主要分布于甘肃陇南、四川广元和凉山、云南西北部金沙江流域等地区[1]。

油橄榄是一种高效经济价值的树种,其主要产品-橄榄油是由成熟的鲜果直接冷榨得到,不经过热处理和化学处理,保留了油橄榄原有的营养价值,含有大量不饱和脂肪酸、维生素、类胡萝卜素、角鲨烯、甾醇、多种酚酸等生物活性成分[2-3],具有增进消化能力、预防心脑血管疾病、促进骨骼和神经系统的发育、防癌抗肿瘤、抗氧化等多种生物功能,享有“液体黄金”和“植物油皇后”之美誉[4]。多酚是橄榄油的主要活性物质之一,已有研究证实多酚具有抗氧化、降脂降糖、抑菌抗炎、抗辐射、延缓骨质疏松和抗肿瘤等多种功能[5-8]。橄榄油含有丰富的叶绿素,叶绿素及其衍生物都是光敏剂,在储存过程中受环境等作用,会使油脂氧化酸败[9]。橄榄油中多酚化合物的存在,有利于橄榄油的储存。

目前植物多酚的提取方法主要有溶剂提取法、生物酶解提取法、微波辅助提取法、超临界流体萃取法、膜技术提取法和超声波辅助提取法等[10],其中,微波辅助提取法是利用微波提高有效成分提取率的一种技术,具有低消耗、高效率、操作简便和节约时间的优点,现已广泛应用于天然产物中有效成分的提取[11-12]。因此,本实验采用响应面法(response surface methodology,RSM)优化油橄榄果中多酚的微波辅助提取工艺,并分析多酚提取液的抗氧化活性,为油橄榄果中多酚化合物的进一步研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

油橄榄鲜果 于2013年8月,采自四川省西昌北河油橄榄基地的皮瓜尔品种。清洗干净冷冻储藏备用。无水碳酸钠、没食子酸、福林酚显色试剂溶液、抗坏血酸(VC)、邻二氮菲 成都科龙化工试剂有限公司;2,2-二苯基-1-苦味基肼(DPPH) 美国Sigma公司;甲醇、CuSO4、FeSO4、EDTANa2均为分析纯。

BT-124S电子天平 德国Sartorius公司;G70D20CN1P-D2(S0)微波炉 广东格兰仕微波炉电器制造有限公司;高速冷冻离心机 德国Thermo公司;RM-220实验室超纯水机 四川沃特尔科技发展有限公司;UV-1750分光光度计 日本岛津公司。

1.2 实验方法

1.2.1 油橄榄果中多酚的提取 将冷冻的油橄榄果实去核,加液氮研成均匀的粉末,迅速称取0.5 g粉末,加入一定量的80%甲醇进行微波辅助提取,提取液高速冷冻离心(4 ℃,8000 r/min,10 min),收集上清液,定容。

1.2.2 油橄榄果中多酚含量测定 采用Folin-Ciocalteu法[13],稍加改进。取上清液100 μL,加3 mL蒸馏水,再加0.2 mL福林酚试剂混匀,约5 min左右加0.8 mL 10%的碳酸钠溶液混匀,避光反应1 h,于765 nm检测吸光值。标准曲线为Y=0.0029X+0.0094,R2=0.9989,其中X为多酚浓度(μg/mL),Y为吸光值,以没食子酸为标准品。

多酚得率(mg/g)=样品液中多酚质量浓度×样品液体积/油橄榄粉末质量/1000

1.2.3 单因素实验 料液比分别以1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g/mL)于420 W的条件下微波辅助提取45 s,探讨料液比对油橄榄果中多酚得率的影响;微波时间分别以30、45、60、75、90 s,以料液比1∶20(g/mL),420 W的条件下进行微波辅助提取,探讨微波时间对油橄榄多酚得率的影响;微波功率分别以140、280、420、560、700 W,于料液比1∶20(g/mL)的条件下微波辅助提取45 s,探讨微波功率对油橄榄果中多酚得率的影响。

1.2.4 响应面法优化实验设计 在单因素实验结果的基础上,以料液比、微波时间和微波功率3个因素为自变量(X),以油橄榄多酚得率为响应值(Y),根据Box-Behnken设计原理,设计三因素三水平响应面实验(表1),预测油橄榄多酚超声辅助提取的最佳工艺。

表1 响应面分析因素及水平表

1.2.5 油橄榄多酚提取液抗氧化活性研究

1.2.5.1 DPPH自由基清除能力的测定 采用分光光度法[14-15],取400 μL不同浓度的油橄榄多酚溶液,加入 2.0 mL 0.15 mmol/L DPPH溶液混匀,室温暗反应30 min,517 nm处测吸光值。以同浓度VC作为阳性对照,实验重复3次。

DPPH自由基清除率(%)=(1-Ai/Aj)×100

式中,Ai为加入样品的反应液吸光值,Aj为用90%乙醇替代样品的的反应液吸光值。

1.2.5.2 羟基自由基清除能力的测定 参照Jin等[16]的方法,稍加改动。取300 μL 0.75 mmol/L的邻二氮菲溶液,加入100 μL不同浓度的油橄榄多酚溶液,加300 μL 0.75 mmol/L的FeSO4溶液,再加入200 μL 0.01% H2O2溶液,于室温环境反应1 h,535 nm处测吸光值。以同浓度VC作为阳性对照,实验重复3次。

羟基自由基清除率(%)=(Ai-Aj)/(Ac-Aj)×100

式中,Ai为加入样品的反应液吸光值,Aj为用水替代样品的反应液吸光值,Ac为用水替代样品和H2O2的反应液吸光值。

1.2.5.3 Cu2+螯合能力的测定 参照Megías等[17]的方法,并适当改进。取400 μL 0.1 mg/mL CuSO4溶液,加入100 μL 4 mmol/L的邻苯二酚紫溶液,再加入200 μL 不同浓度的油橄榄多酚溶液,室温反应20 min后于5000 r/min离心10 min,632 nm处测吸光值。以同浓度EDTANa2作为阳性对照,实验重复3次。

Cu2+螯合率(%)=(1-Ai/Aj)×100

式中,Ai为加入样品的反应液吸光值,Aj为用水替代样品的反应液吸光值。

1.3 数据处理

所有数据均是3次重复实验的平均值,应用Microsoft Excel 2010、Origin 8.0、SPSS 20对实验数据进行处理分析并作图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

2.1.1 料液比对油橄榄多酚得率的影响 由图1可知,随着料液比的增加,多酚得率不断增加,当料液比增加到1∶20(g/mL)时,多酚得率达到最大6.6499 mg/g;随后多酚得率随着料液比的增加而减少。这可能是当料液比为1∶20(g/mL)时,材料中的多酚基本溶出,再增加提取剂的量则将多酚的浓度稀释,同时,更多的溶剂可能会消耗微波的能量,多酚得率会有所下降[18]。考虑到成本和后续浓缩,将优化料液比选为1∶10、1∶20、1∶30(g/mL)。

图1 料液比对多酚得率的影响Fig.1 Effect of material-liquid ratio on the extraction yield of polyphenols

2.1.2 微波时间对多酚得率的影响 由图2 可知,当微波时间由30 s增加到45 s的过程中,油橄榄果中的多酚得率大幅度增加;且在45 s时,多酚的得率达到最大值为6.4060 mg/g,之后多酚得率有所降低。这可能是提取时间过长,微波的强烈作用使多酚物质有所破坏,引起多酚得率降低。因此,将优化微波时间选为30、45、60 s。

图2 微波时间对多酚得率的影响Fig.2 Effect of microwave processing time on the yield of polyphenols

2.1.3 微波功率对多酚得率的影响 由图3 可知,油橄榄果中的多酚得率先随着微波功率的增加而增加,这是由于微波功率的增加,引起细胞内部结构变化和细胞壁的破坏,有利于油橄榄果中的多酚溶出。当微波功率达到420 W时,多酚得率达到最大值为6.3988 mg/g。之后微波功率的增加可能产生局部瞬间高温破坏多酚的结构,引起多酚得率降低。因此,将优化微波功率选为280、420、560 W。

图3 微波功率对多酚得率的影响Fig.3 Efeect of microwave power on the yield of polyphenol

2.2 响应面法优化油橄榄多酚提取工艺

2.2.1 响应面实验设计及结果 利用Design-Expert8.0软件对表2中的实验结果进行二次多元回归拟合,得到油橄榄果中的多酚得率(Y)与料液比(X1)、微波时间(X2)和微波功率(X3)之间的回归模型为:

Y=6.69+0.59X1+0.27X2+0.25X3-0.26X1X2-0.21X1X3-0.023X2X3-0.61X12-0.43X22-0.18X32

表2 Box-Behnken中心组合设计方案及实验结果

2.2.2 回归模型方差分析与显著性检验 利用Design-Expert8.0软件对回归模型进行方差分析(analysis of variance,ANOVA)(表3),结果显示,模型极显著(p<0.01),失拟项不显著(p>0.05);R2=0.9691,校正R2=0.9294,说明该模型拟合度较好;CV=2.92%,该值相对较小,显示实验操作具有可信度。

表3 回归模型方差分析

注:表中**为极显著(p<0.01),*为显著(p<0.05)。

因此该模型可以用于预测油橄榄多酚微波辅助提取的最佳工艺。各因素对油橄榄多酚得率的影响程度依次是料液比>微波时间>微波功率。只有料液比和微波时间的交互作用显著。

2.2.3 响应面分析 根据回归方程,绘制多酚得率和实验因素料液比、微波时间和微波功率的响应面图(图4～图6)。等高线的形状可以反映出交互作用的强弱,椭圆形表明交互作用显著,而圆形则与之相反,有闭合的椭圆或圆形则表明有极大值[19]。由图4可知,料液比和微波时间的交互作用显著,其他交互作用不显著,这与表3中的分析结果一致。

图4为当微波功率为420 W时,料液比和微波时间的响应面图。微波时间一定时,随着料液比的增加,油橄榄多酚得率增大;当料液比达到一定值之后,多酚得率随之减少;当料液比一定时,多酚得率随着微波时间的增加,先增大后减少。图5为当微波时间为45 s时,料液比和微波功率的响应面图。微波功率一定时,随着料液比的增加,多酚得率迅速增;当料液比达到一定值之后,多酚得率缓慢减少;当料液比一定时,多酚得率随着微波功率的增加而增加。图6为当料液比为1∶20(g/mL)时,微波时间和微波功率的响应面图。微波功率一定时,随着微波时间的增加,多酚得率增大,当微波时间达到一定值之后,多酚得率随之减少;当微波时间一定时,多酚得率随着微波功率的增加而增加。

图4 料液比和微波时间对多酚得率影响的响应面图Fig.4 Response surface of material-liquid ratio and microwave processing time on the yield of polyphenols

图5 料液比和微波功率对多酚得率影响的响应面图Fig.5 Response surface of of material-liquid ratio and microwave power on the yield of polyphenols

图6 微波时间和微波功率对多酚得率影响的响应面图Fig.6 Response surface of microwave processing time and microwave power on the yield of polyphenols

2.2.4 最佳工艺参数与验证实验 通过响应面优化,得到的微波辅助油橄榄多酚提取的最佳工艺参数为料液比1∶23.2(g/mL)、微波时间48.15 s、微波功率474.6 W,在此条件下油橄榄多酚得率 为6.8833 mg/g。

考虑到实际操作条件,将最佳工艺参数调整为料液比1∶23(g/mL)、微波时间48 s、微波功率490 W,在此条件下进行3次重复验证实验,油橄榄多酚实际平均得率为6.9659 mg/g,与预测值的相对误差为1.12%。表明回归模型拟合度高,可用于优化微波辅助提取油橄榄多酚的工艺条件,具有实用价值。

2.3 油橄榄多酚提取液抗氧化活性分析

2.3.1 多酚提取液对DPPH自由基清除能力 由图7可知,油橄榄多酚提取液和VC对DPPH自由基的清除能力接近,在低浓度范围内,清除率与质量浓度有明显的量效关系;高浓度时,清除率趋于平缓。当质量浓度大于0.092 mg/mL时,清除率基本稳定在87.85%,其IC50为0.055 mg/mL。表明油橄榄多酚提取液具有较强的清除DPPH自由基的能力。

图7 多酚提取液和VC清除DPPH自由基的能力Fig.7 Scavenging capacity of polyphenol extracts and VC on DPPH radical

2.3.2 羟基自由基清除能力 由图8可知,油橄榄多酚提取液对羟基自由基的清除能力低于VC对羟基自由基的清除能力,在低浓度范围内,清除率与质量浓度有较好的量效关系;高浓度时,清除率趋于平缓。当质量浓度达到0.288 mg/mL 时,多酚提取液对羟基自由基的清除率达到最大值68.12%,其IC50为0.188 mg/mL。表明油橄榄多酚提取液具有一定的清除羟基自由基的能力。

图8 多酚提取液和VC清除羟基自由基的能力Fig.8 Sacvenging capacity radical of polyphenol extracts and VC on hydroxyl

2.3.3 多酚提取液对Cu2+螯合能力 由图9可知,油橄榄多酚提取液对Cu2+的螯合能力略低于VC对Cu2+的螯合能力,在考察浓度范围内,螯合率随着样品浓度的增大逐渐增强,与浓度有明显的量效关系。当质量浓度为0.288 mg/mL时,油橄榄多酚提取液对Cu2+的螯合率为54.18%,其半螯合浓度为0.260 mg/mL。表明油橄榄多酚提取液具有较强的Cu2+螯合能力。

图9 多酚提取液和EDTANa2对Cu2+螯合的能力Fig.9 Chelating capacity of Cu2+ of polyphenol extracts and EDTANa2

3 结论

3.1 利用响应面法优化得到微波辅助提取油橄榄果中多酚的最佳工艺条件为:料液比1∶23(g/mL),微波时间48 s,微波功率490 W,在此条件下进行3次平行重复实验,得到油橄榄多酚实际平均得率为6.9659 mg/g,与预测值的相对误差为1.12%。说明此优化工艺参数可靠,具有实用价值。

3.2 通过体外抗氧化实验表明,油橄榄多酚提取液对DPPH自由基和羟基自由基都具有一定的清除能力,对Cu2+具有一定的螯合能力;清除DPPH自由基的IC50为0.055 mg/mL,清除羟基自由基的IC50为0.188 mg/mL,对Cu2+的半螯合浓度为0.277 mg/mL。因此,油橄榄鲜果中的多酚具有较好的抗氧化活性。

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Study on the microwave-assisted extraction and antioxidant capacity of polyphenols from olive fruits

WANG Han-dong1,LIU Jing1,LIU Lu1,XIANG Chun-rong1,LI Tian2,YANG Ze-shen3,DING Chun-bang1，*

(1.College of Life Sciences,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China；2.College of Agronomy,Sichuan Agricultural University,Chengdu 611130,China；3.Liangshan Zhongze New Tech Development Co.Ltd,Xichang 615000,China)

Response surface analysis methodology(RSM)was applied to optimize the microwave-assisted extraction conditions of polyphenols from fresh olive fruits,furthermore,the study investigated the antioxidant activity of polyphenols extracts. Based on single factor experiments,a quadratic regression model was established according to the Box-Behnken experimental design. The optimum microwave-assisted conditions were material-liquid ratio 1∶23(g/mL),microwave time 48 s,microwave power 490 W. Validation experiments were carried out at the optimum microwave-assisted conditions,the average yield of polyphenols was 6.9659 mg/g,the relative error between experimental values and the predicted value was 1.12%. It showed that the optimization process was feasible. The maximum inhibition percentage of DPPH and hydroxyl radical of polyphenol extracts were 87.85% and 68.12%,respectively. The IC50value were 0.055 mg/mL and 0.188 mg/mL,respectively. In addition,the maximum chelating rate of Cu2+was 54.18%,the Cu2+chelating concentration in half of polyphenols extracts was 0.277 mg/mL.

olive;polyphenols;response surface analysis methodology(RSM);microwave-assisted extraction;antioxidant capacity

2015-02-12

王寒冬(1993-)，女，硕士研究生，主要从事油橄榄品种选育研究，E-mail:1091228832@qq.com。

*通讯作者:丁春邦(1966-)，女，博士，教授，主要从事植物学教学与科研工作，E-mail:dcb@sicau.edu.cn。

四川省科技厅科技支撑计划项目(2013NZ0047)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)21-0204-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.034