张圣方,赵龙玉,王 雪,赵凤春,杨正友

(山东农业大学生命科学学院微生物系,农业微生物重点实验室,山东泰安 271018)

泰山蛹虫草多糖对免疫抑制小鼠血清蛋白含量和体内抗氧化能力的影响

张圣方,赵龙玉,王 雪,赵凤春,杨正友*

(山东农业大学生命科学学院微生物系,农业微生物重点实验室,山东泰安 271018)

目的:研究泰山蛹虫草多糖(Cordycepstaishanensispolysaccharide,CTP)对免疫抑制小鼠血清蛋白含量和抗氧化能力的影响。方法:通过对小鼠灌服多糖实验,观察CTP对小鼠血清总蛋白、白蛋白及球蛋白含量和抗氧化能力的影响。结果:与环磷酰胺(Cyclophosphamide,CY)模型组比较,三个CTP组的血清总蛋白、球蛋白和白蛋白含量均极显著增高(p<0.01);三个CTP组的红细胞SOD活性和血清CAT活性均显著提高(p<0.01或p<0.05),红细胞MDA含量均极显著减少(p<0.01)。结论:CTP能显著提高CY所致的免疫损伤小鼠的血清蛋白含量,在一定程度上CTP能减轻CY对小鼠肝脏的损害作用;CTP也能改善CY所致免疫损伤小鼠的抗氧化能力。

泰山蛹虫草多糖,环磷酰胺,免疫损伤小鼠,血清蛋白,体内抗氧化

泰山虫草(Cordycepstaishanensis)是一种自然野生的蛹虫草,隶属于子囊菌门(Ascomycota)、核菌纲(Pyrenomycetes)、麦角菌目(Clavioipitales)、麦角菌科(Clavicipitaceae)、虫草属(Cordyceps)中的子囊真菌[1]。蛹虫草多糖是从蛹虫草子实体或菌丝体中提取的具有多种生物学和免疫学活性的真菌多糖。它具有抗肿瘤、抗氧化、抗病毒、提高免疫力等功能,近年来已引起人们的广泛关注[2-8]。一些研究也发现多糖能使血清蛋白浓度升高[9]。但是泰山蛹虫草多糖(CTP)是否在生物体内具有明显的抗氧化功能,是否能够提高血清蛋白含量并具有护肝解毒的作用,目前仍无相关文献报道。

肝脏是蛋白质合成的重要器官之一,是合成血浆白蛋白的器官[10]。血清总蛋白主要来自肝脏的合成和肠道的吸收,主要包括白蛋白和球蛋白。肝脏损伤时,蛋白质合成障碍可导致总蛋白和白蛋白含量减少。研究发现注射环磷酰胺(CY)会致使小鼠总蛋白、球蛋白、白蛋白降低[11],还会对小鼠正常组织细胞造成了损伤,在实验动物氧化和抗氧化方面有很大的影响[12]。CY是目前应用的免疫抑制剂中作用最强的药物之一,研究认为CY可广泛作为免疫抑制模型的造型剂[13-16]。

本研究通过小鼠灌服多糖实验,检测小鼠血清蛋白含量,血液SOD、CAT活性和MDA含量的变化,旨在探究CTP对CY所致的免疫抑制小鼠肝脏功能恢复和体内抗氧化能力的影响,为CTP制剂的应用推广提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

泰山蛹虫草菌(药乡-3)由山东省泰安市农业科学院食用菌研究所提供。

总蛋白(TP)试剂盒、白蛋白(ALB)试剂盒 上海荣盛生物技术有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、过氧化氢酶(CAT)试剂盒 南京建成生物工程研究所;柠檬酸钠(分析纯) 天津市凯通化学试剂有限公司;注射用环磷酰胺(优级纯) 江苏恒瑞医药股份有限公司;ICR清洁级昆明小鼠,雄性,体重(20±2)g,由泰山医学院动物实验中心提供。

TGL-16B型台式离心机 上海安亭科学仪器厂;WSZ-160A型漩涡振荡器 上海一恒科技有限公司;RXZ-300B型人工气候箱 宁波江南仪器厂;751G型紫外分光光度计 美国Amersham Biosciences公司。

1.2 实验方法

1.2.1 制备泰山蛹虫草多糖制剂 本实验室采用高效提取和纯化蛹虫草子实体多糖的方法[17-18]获得的CTP(子实体多糖含量测定为5.10%)。对本实验室栽培出的泰山蛹虫草子实体进行水提醇沉提取粗多糖,然后先后经过sevage法脱蛋白、活性炭除色素、透析除小分子杂质和SephadexG-75柱过滤层析,最后得到CTP(苯酚-硫酸法测定多糖质量分数为66.94%)。

1.2.2 动物分组和给药 60只昆明小鼠随机平均分为五组:正常对照组(C组)、CY模型组和三个不同剂量的CTP组。饲养期间小鼠自由摄食、饮水。依照表1的给药方案每天进行定时灌胃,每次每只小鼠灌胃相应浓度的CTP溶液或蒸馏水,连续灌胃19d;第20d,对每只小鼠腹腔注射CY或等体积的生理盐水。

1.2.3 血样采集与处理 腹腔注射CY 24h后,所有小鼠摘眼球采血,每10mL血样加1mL 2.6%的柠檬酸钠溶液来抗血凝,分装于Eppendorf管中,-4℃保存,待测。随后颈椎脱臼处死小鼠。

1.2.4 小鼠免疫器官指数的测定 小鼠颈椎脱臼处死后,摘取脾脏和胸腺,除去表面的结缔组织,分析天平称重。在处死小鼠前要同条件称量每只小鼠的重量。计算免疫器官指数:胸腺指数=胸腺重量(mg)/小鼠活重(g);脾脏指数=脾脏重量(mg)/小鼠活重(g)。

表1 实验小鼠分组和给药方案Table 1 Animal grouping and drug administration of experimental mice

1.2.5 指标的测定 分别按试剂盒说明书测定,血清总蛋白(TP)测定采用双缩脲法,血清白蛋白(ALB)测定用溴甲酚绿法,血清球蛋白(GLO)含量为血清总蛋白含量与血清白蛋白含量的差值;SOD活性测定采用氮蓝四唑比色法,MDA含量测定采用硫代巴比妥酸比色法,CAT活性测定采用钼酸铵比色法。用紫外分光光度计测得对应OD值。

1.3 数据统计处理

2 结果与讨论

2.1 实验小鼠的胸腺指数和脾脏指数

实验小鼠的胸腺指数和脾脏指数见表2,对于胸腺指数,与C组相比,CY模型组和低剂量CTP组小鼠胸腺指数极显著降低(p<0.01),中剂量和高剂量CTP组小鼠胸腺指数与C组差异均不显著(p>0.05);与CY模型组相比较,中、高剂量CTP组小鼠胸腺指数显著增加(p<0.05或p<0.01)。

对于脾脏指数,与C组相比较,CY模型组小鼠脾脏指数极显著降低(p<0.01),高剂量CTP组小鼠脾脏指数显著提高(p<0.05),低、中剂量CTP组小鼠脾脏指数与C组差异均不显著(p>0.05);与CY模型组对比,三个不同剂量的CTP组小鼠脾脏指数均极显著提高(p<0.01)。

Table 2 The effect of thymus and

组别胸腺指数(mg/g)脾脏指数(mg/g)C组4.040±0.059##3.170±0.055##CY模型组3.084±0.355**2.154±0.242**低剂量+CY组3.163±0.064**3.011±0.144##中剂量+CY组3.855±0.089##3.147±0.105##高剂量+CY组3.632±0.389#3.476±0.119*##

注:与C组比较,*p<0.05,**p<0.01;与CY模型组比较,#p<0.05,##p<0.01，表3、表4同。

表3 实验小鼠血清总蛋白、球蛋白和白蛋白的含量±s,n=12)Table 3 Contents of TP,GLO and ALB in the serum of experimental ±s,n=12)

表4 实验小鼠血液抗氧化指标测定结果±s,n=12)Table 4 Antioxidant index of the blood in experimental ±s,n=12)

胸腺是T淋巴细胞发育成熟的场所,为中枢免疫器官,其细胞增殖分化受抑制会使机体白细胞总数尤其是淋巴细胞总数降低,使机体免疫功能下降[19]。脾脏是动物体内最大的外周免疫器官,是T、B淋巴细胞定居和对抗原物质产生免疫应答及免疫效应物质(如抗体等)的重要场所。脾脏指数能反映脾脏的发育和功能状况,间接反映机体的免疫水平[20]。检测胸腺和脾脏指数的变化可以直观综合地反映药物对机体免疫功能的影响。与C组相比较,CY模型组小鼠脾脏指数和胸腺指数都极显著降低(p<0.01),在一定程度上可以表征注射剂量为100mg/kg·bw的CY 24h后对小鼠起到了构造免疫抑制模型的作用。

通过表2可知,CTP能够提高小鼠脾脏和胸腺指数,对CY的抑制有正调节作用。免疫器官指数的增加,说明CTP可在一定程度上促进小鼠机体的细胞免疫,为血清蛋白含量的提高提供了条件。

2.2 实验小鼠血清蛋白含量的变化

实验小鼠血清蛋白含量的变化见表3,对于总蛋白含量,与C组比较,CY模型组小鼠血清总蛋白含量极显著降低(p<0.01),低、中、高剂量的CTP组与C组差异均不显著(p>0.05),不过中剂量CTP组的总蛋白含量已超过C组;与CY模型组比较,三个不同剂量的CTP组血清总蛋白含量均极显著增高(p<0.01)。

对于球蛋白含量,与C组比较,CY模型组小鼠血清球蛋白含量极显著降低(p<0.01),三个不同剂量的CTP组与C组差异均不显著(p>0.05),其中,低、中、高剂量的CTP组球蛋白含量均已超过了C组;与CY模型组比较,三个不同剂量的CTP血清球蛋白含量均极显著增高(p<0.01)。

对于白蛋白含量,与C组比较,CY模型组小鼠血清白蛋白含量极显著降低(p<0.01),三个不同剂量的CTP组与C组差异均不显著(p>0.05),不过中剂量CTP组的白蛋白含量已高于C组;与CY模型组比较,三个不同剂量的CTP组血清白蛋白含量均极显著增高(p<0.01)。

通过以上结果可知,中剂量的CTP在促进小鼠血清蛋白含量的增加上效果最为明显。

肝脏受损伤时,蛋白质发生合成障碍可导致血浆球蛋白和白蛋白含量减少。临床上以检测血浆蛋白的含量来协助诊断肝脏疾患,并作为疗效观察,预后判断的指标[21]。有研究表明给大鼠腹腔注射一定量的CY,其能与大鼠组织细胞中功能基团如DNA,蛋白质分子中氨基、疏基、羟基等作用,发生烷化作用,造成大鼠肝功能抑制,总蛋白、白蛋白、球蛋白降低及外周血白细胞、红细胞、血小板数减少[22]。李树鹏等认为,多糖能使血清白蛋白浓度升高可能是由于多糖促进TNF的分泌,TNF能作用于肝脏,使血清白蛋白合成增加[23]。同时,血清蛋白含量的升高与机体免疫功能增强也有很大的关系,血清蛋白主要由白蛋白和球蛋白组成,球蛋白比重很大,由单核巨噬细胞系统产生。本实验结果表明,与CY模型组比较,三个不同剂量的CTP均能提高免疫抑制小鼠血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白的含量,在一定程度上改善CY对肝脏的损伤,促使机体恢复正常。CTP的作用机制可能是多糖调节细胞免疫,血清球蛋白数量增加而引起总蛋白浓度上升;还有可能是因为多糖的护肝解毒的作用。

2.3 实验小鼠血液抗氧化指标测定结果

实验小鼠血液抗氧化指标结果见表4,对于SOD活性,与C组比较,CY模型组和低、中、高剂量的CTP组的红细胞SOD活性均极显著降低(p<0.01);与CY模型组比较,三个不同剂量的CTP组的红细胞SOD活性均极显著提高(p<0.01)。

对于MDA含量,与C组比较,CY模型组小鼠红细胞MDA含量极显著增加(p<0.01),低剂量CTP组的MDA含量显著增加(p<0.05),中、高剂量CTP组的MDA含量与C组差异不显著(p>0.05);与CY模型组比较,三个不同剂量的CTP组的红细胞MDA含量均极显著减少(p<0.01)。

对于CAT活性,与C组比较,CY模型组小鼠血清CAT活性极显著降低(p<0.01),低、中剂量CTP组血清CAT活性显著降低(p<0.05);与CY模型组比较,三个不同剂量的CTP组的血清CAT活性均显著提高(p<0.01或p<0.05),且CAT活性随着多糖浓度的增大而增高。

生物在长期进化过程中,自身形成了防御过氧化损害系统。正常状态下,促氧化与抗氧化之间保持着一定的平衡状态,如果活性氧自由基的产生超过了机体的清除能力,或机体抗氧化系统受损时,体内自由基蓄积,会引起脂质氧化,产生过量脂质过氧化物,损伤核酸、蛋白质等细胞成分。研究表明,许多多糖对物理、化学及生物来源的多种活性氧具有清除作用,提高抗氧化酶活性及机体抗氧化能力。据报道,油菜花粉多糖能拮抗环磷酰胺,降低小鼠血清中MDA含量,使血清SOD活性恢复至正常水平[24]。猴头菇多糖可以明显提高小鼠血清的SOD和CAT的活性以及降低血清MDA的含量,具有良好的抗氧化能力[25]。Li等研究发现蛹虫草子实体多糖(CMP)能抑制线粒体损伤,清除活性氧,增加体内SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)以及CAT的活性,从而具有抗衰老的功效[26]。本实验结果显示,CTP能显著提高小鼠血液SOD和CAT的活性,并降低MDA的含量,表明其能提高机体抗氧化能力,有效预防机体的脂质过氧化,与上述文献报道结果相似。

研究表明[27-28]多糖对免疫抑制状态下的小鼠可通过抗氧化作用调节细胞内氧自由基水平,保护免疫系统细胞免受损伤,从而增强机体的免疫功能;本研究中CTP提高血清球蛋白含量进而增强小鼠免疫调节作用可能与抗氧化功能的增强相关,其机理有待进一步研究。

3 结论

本研究初步证实泰山蛹虫草多糖能显著降低环磷酰胺对小鼠的免疫抑制作用,提高环磷酰胺所致的免疫损伤小鼠的血清蛋白含量,对肝脏具有一定的保护作用,剂量为200mg/kg·bw的泰山蛹虫草多糖的促进作用最为明显;抗氧化研究表明,泰山蛹虫草多糖可以通过提高一些抗氧化酶的活性和降低体内氧化反应产物的含量来提高机体的抗氧化能力。本研究为泰山蛹虫草的开发利用及其多糖制剂的应用推广提供理论依据和参考,同时多糖结构及构效关系方面的研究有待于进一步开展。

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Effect ofCordycepstaishanensispolysaccharide on protein content in serum and antioxidant activity in immunosuppressive mice

ZHANG Sheng-fang,ZHAO Long-yu,WANG Xue,ZHAO Feng-chun,YANG Zheng-you*

(Department of Microbiology,College of Life Science,Key Laboratory for Agriculture Microbiology,Shandong Agricultural University,Tai’an 271018,China)

Objective:To study the effects ofCordycepstaishanensispolysaccharide(CTP)on protein content in serum and antioxidant activity in immunosuppressive mice. Methods:Through gavage experiments in mice,the effects of CTP on the amount of total proteins(TP),albumin(ALB)and globulin(GLO)in serum and antioxidant activity were analyzed. Results:Compared with the CY model group,the amount of TP,ALB and GLO in serum were increased significantly(p<0.01),the activities of superoxide dismutase(SOD)in erythrocytes and catalase(CAT)in serum were significantly increased(p<0.05 orp<0.01)and the content of malondialdehyde(MDA)in erythrocytes were decreased significantly(p<0.01)in the three CTP treatment groups. Conclusion:CTP could significantly increase protein content in serum and reduce the damage at some level to liver function of immunosuppressive mice induced by CY. CTP could also improve antioxidant activity of CY-induced immunosuppressive mice to a certain extent.

Cordycepstaishanensispolysaccharide;cyclophosphamide;immunosuppressive mice;serum proteins;antioxidant activityinvivo

2014-08-25

张圣方(1989-),男,硕士研究生,研究方向:食品质量与安全。

*通讯作者:杨正友(1971-),男,博士,教授,研究方向:食品质量与安全,及食品微生物学。

国家自然科学基金(30972050,31271873);山东省自然科学基金(ZR2010CM015)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)11-0332-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.059