丁文武,丛林娜,孟 丽,夏云空

(1.西华大学,生物工程学院,四川成都 610039;2.中国科学院上海高等研究院,低碳转化科学与工程重点实验室,上海 201210;3.山东胜通集团股份有限公司,山东东营 257500;4.四川大学,生命科学学院,四川成都 610065)

聚乙二醇/硫酸铵双水相体系萃取大豆脂肪氧合酶的研究

丁文武1,丛林娜2,孟 丽3,夏云空4

(1.西华大学,生物工程学院,四川成都 610039;2.中国科学院上海高等研究院,低碳转化科学与工程重点实验室,上海 201210;3.山东胜通集团股份有限公司,山东东营 257500;4.四川大学,生命科学学院,四川成都 610065)

采用聚乙二醇(PEG)/硫酸铵[(NH4)2SO4]双水相体系对大豆中脂肪氧合酶进行分离萃取研究;通过综合考察酶分配系数、相比和回收率,探讨了(NH4)2SO4、PEG2000、NaCl浓度以及pH对脂肪氧合酶萃取的影响,并通过正交实验进一步优化实验条件,结果表明在单一因素下的最佳工艺条件为:(NH4)2SO415%(wt%)、PEG2000 13%(wt%)、NaCl 1%(wt%)、pH5.8;正交实验优选出的最佳工艺条件为:(NH4)2SO417%(wt%)、PEG2000 13%(wt%)、pH5.2,可获得酶的分配系数最高可达9.710,萃取率为87.6%。

脂肪氧合酶,双水相萃取系统,聚乙二醇,硫酸铵

脂肪氧合酶简称脂氧酶(lipoxygenase,LOX),属氧化还原酶。1947年Theorell等首次从大豆中提取脂肪氧合酶的结晶,相对分子量为10.2万,等电点范围为5.7～6.2[1]。许多研究结果表明脂肪氧合酶在植物生理,如植物萌发、生长、发育、衰老和抗性等物质转化中起某种重要调节作用,可以运用于植物抗病、抗虫和伤害反应,以及含有类胡萝卜素的植物或海洋食品物质的漂白等,因而是一种非常重要的酶[2]。

双水相萃取(ATPS)技术是近些年来发展起来的物质分离工艺,与传统分离方法相比,ATPS具有条件温和、产品活性损失小、分离步骤少、无有机溶剂残留、操作简单等优点[3-4],因而许多研究者以双水相法对多种生物酶进行了萃取研究,并取得了很多非常有意义的研究成果[5-8]。

本文采用PEG/(NH4)2SO4双水相体系,系统研究了影响脂肪氧合酶萃取的各个因素,对脂肪氧合酶在该体系中的分配行为进行初步研究,并确定最佳工艺条件,为脂肪氧合酶分离及扩大应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

大豆 济南大润发历下店;PEG2000,分析纯;亚油酸 分析纯;氯化钠,分析纯 国药集团化学试剂有限公司;硫酸铵,分析纯 天津市广成化学实际有限公司;无水乙醇,分析纯;石油醚,分析纯 天津市富宇精细化工有限公司;吐温20,化学纯 天津市科密欧化学试剂有限公司。

酸度计 上海般特仪器制造有限公司;电热恒温水浴锅 上海森信仪器有限公司;双光束紫外可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司。

1.2 实验方法

脱脂豆粉的制备:大豆经搅拌器打碎,用40目标准检验筛去皮,称取200g大豆粉,用石油醚[固液比为m(g)∶v(mL)=1∶5]浸泡5次,每次浸泡3h,干燥后4℃下储存备用[9]。

水浸提法制备大豆粗酶液:把脱脂豆粉70g,加水350g,搅拌1h(室温20℃),4000r/min条件下离心20min,取上清液即为粗酶液,4℃下储存备用。

1.2.1 酶活测定 底物溶液的配制:将0.25mL的吐温20分散于10mL pH9.0的硼酸盐缓冲溶液中,摇动下逐滴加入0.27mL亚油酸,充分混合,再加入1mol/L的NaOH溶液,使体系澄清,用1mol/L的HCl溶液调pH为9.0,然后定容到500mL,保存备用[9-10]。

酶活测定:25℃下,在1min内反应体系在波长为234nm处的吸光度增加0.001作为一个酶活单位[9]。取0.2mL粗酶液加到1.5mL的底物溶液中,混匀后于25℃恒温水浴锅中反应3min,用5mL无水乙醇终止反应后加入5mL蒸馏水,混匀后用吸光光度计在波长234nm处测定反应液的吸光度。空白实验为加入粗酶液和无水乙醇后,再加入底物溶液,同样条件下测定吸光度[9]。

1.2.2 双水相系统相图制作 精确称取40%(wt%,以下同)PEG2000溶液5.0g于试管中,不断滴加已配好的30%(NH4)2SO4溶液,震荡混合并观察其澄清度,直至出现浑浊为止,同时记录(NH4)2SO4溶液的加入量(g),然后加入少量的水,使其澄清,再继续向体系中滴加(NH4)2SO4溶液,使其再次达到浑浊并记录(NH4)2SO4溶液的加入量,如此反复操作,计算每次达到浑浊时,PEG2000和(NH4)2SO4在系统总量中的浓度(wt%),以PEG2000浓度为纵坐标,(NH4)2SO4浓度为横坐标作图,即得到一条双节线的相图。

有关计算公式:相比R=Vt/Vb,其中:Vt-上相体积(mL),Vb-下相体积(mL);

分配系数Ke=上相酶活/下相酶活;

萃取率Ye(%)=RKe/(1+RKe)×100。

1.2.3 双水相提取脂肪氧合酶优化工艺研究 以单因素实验得到的影响因素作为参考,再用正交实验对双水相提取大豆中脂肪氧合酶的研究进行优化。选择PEG2000的浓度、(NH4)2SO4的浓度、pH水平因素,如表1所示,进行正交实验并分析。

表1 正交实验水平因素表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 结果与讨论

2.1 双水相体系相图

亲水性高聚物PEG和(NH4)2SO4在水中之所以能够形成两相,是由于高聚物的不相溶性或盐析作用造成的,但只有这两种物质在水中达到一定浓度时才能形成两相[11]。双水相形成的条件和定量关系可用相图表示,只有当成相组分的配比在曲线的上方时,才能自动分为两相。在PEG2000浓度为40%,测定PEG/(NH4)2SO4双水相体系相图,结果见图1。

图1 PEG/(NH4)2SO4双水相体系相图Fig.1 The phase diagram of PEG/(NH4)2SO4 system

2.2 (NH4)2SO4浓度对萃取的影响

2.3 PEG2000浓度对萃取的影响

PEG2000浓度对脂肪氧合酶萃取的影响如表3所示。当(NH4)2SO4固定为15%时,随着PEG浓度的增加,R、Ke和Ye均先增大后减少。究其原因,当(NH4)2SO4浓度一定时,增大PEG用量,会使体系中成相物质的总浓度增加,同时使萃取相的极性减小,但由于脂肪氧合酶是具有部分极性的非极性物质,因此其在萃取相中的溶解度也将增加,从而使Ke和R不断增大[14],但是PEG2000浓度太高,会使萃取相的极性降低太多,进而使具有强极性的(NH4)2SO4的溶解度降低而增加了体系黏度,阻止了相间分子转移,从而在两相之间形成乳化层,使下相中的酶滞留在两相之间,反而导致了Ke和Ye的降低。因此PEG2000浓度最佳为13.0%。

表2 (NH4)2SO4浓度对脂肪氧合酶萃取的影响Table 2 Effect of (NH4)2SO4 concentration on lipoxygenase extraction

表3 PEG2000浓度对脂肪氧合酶萃取的影响Table 3 PEG2000 concentration on lipoxygenase extraction

2.4 NaCl浓度对萃取的影响

实验通过加入不同质量分数的NaCl考察无机盐对双水相体系分配行为的影响,结果如表4所示。由表中可以看出,在PEG2000为13%、(NH4)2SO4为15%的条件下,随着NaCl浓度增加,Ke呈现出减小的趋势,而Ye和R却呈现先增加后减小的趋势。这是由于在PEG/(NH4)2SO4双水相体系中加入电解质,其阴阳离子在两相间会有不同的分配,形成相间电势差,而且盐分的加入可以加快其分相速度[15],因此随着NaCl浓度的增加,萃取相的极性也随之增强,从而使脂肪氧合酶的溶解度下降,Ke呈现出减小的趋势[15],因此在本实验当中确定NaCl浓度最佳为1.0%。

表4 NaCl浓度对脂肪氧合酶萃取的影响Table 4 NaCl concentration on lipoxygenase extraction

2.5 pH对萃取的影响

据报道,体系pH与蛋白质的等电点相差越大,蛋白质在两相中分配越不均匀,pH的微小变化甚至可能使蛋白质分子的分配系数改变2～3个数量级[16]。本文体系pH的变化对脂肪氧合酶萃取的影响如表5所示。从表可知,随着体系pH的增加,各参数都呈现出先增大后减小的趋势,当pH为5.8时,Ke和Ye均达到最大值,因而确定萃取的最佳pH为5.8。

表5 pH对脂肪氧合酶萃取的影响Table 5 pH concentration on lipoxygenase extraction

2.6 正交实验

由表6所示的实验结果可知,影响萃取效果的主次因素为:(NH4)2SO4浓度>pH>PEG2000浓度,最优条件为A3B3C1,即在(NH4)2SO4质量浓度为17%、PEG(wt%)为15%,pH为5.2的条件下,Ke达到最大,因该组合条件不在9个正交实验组合中,故在最优实验组合条件下进行分离萃取,所得Ke值为9.312,Ye值为89.5%。表6中的8号实验结果虽然比最优实验结果高4.1%,但是两者相差不大,可以认为是在误差范围内,因而,通过正交实验得到的最佳实验条件是合理的;而另一方面,8号实验的PEG2000 添加量比最优实验的添加量少,因此,从经济因素考量,可以将8号实验条件作为作为最佳实验条件,即(NH4)2SO417%、PEG2000 13%、pH5.2,此条件下获得酶的分配系数为9.710,萃取率为87.6%。

表6 正交实验结果与分析Table 6 Results and analysis of orthogonal test

3 结论

本文采用聚乙二醇(PEG)/硫酸铵[(NH4)2SO4]双水相体系对大豆中脂肪氧合酶的萃取分离进行了研究。综合考察酶分配系数、相比和萃取率,探讨了(NH4)2SO4、PEG2000、NaCl浓度以及pH对脂肪氧合酶萃取的影响,并通过正交实验进一步优化实验条件,结果表明,单一因素下的最佳工艺条件为:(NH4)2SO415%、PEG2000 13%、NaCl 1.0%、pH5.8;正交实验和验证实验优选出的最佳工艺条件为:(NH4)2SO417%、PEG2000 13%、pH5.2,此条件下获得酶的分配系数为9.710,萃取率为87.6%。

[1]蔡琨,方云,夏咏梅.植物脂肪氧合酶的研究进展[J].精细化工,2003,23(增):23-24.

[2]蔡琨,方云,夏咏梅,等.大豆脂肪氧合酶的提取及影响酶活因素的研究[J].林产化学与工业,2004,24(2):52-54.

[3]董娜,董文宾,田颖.双水相萃取和壳聚糖沉淀相结合分离猪胃蛋白酶[J].食品科技,2011,36(1):26-29.

[4]Walter H,Krob E J. Effect of rapidity of phase separation on the efficiency of cell fractionation by partitioning in aqueous two-phase systems[J]. Biochem Biophys Acta,1988,966(1):65-72.

[5]冯自立,马娜.无花果蛋白酶在PEG/(NH4)2SO4双水相体系中的分配行为[J].食品科学,2010,31(19):67-68.

[6]王巍杰,徐长波.双水相萃取藻蓝蛋白的研究[J].粮油加工,2010(5):92-95.

[7]陈利梅,李德茂,孙秀平.聚乙二醇/硫酸铵双水相体系萃取葡萄糖氧化酶的研究[J].食品工业科技,2010(5):209-211.

[8]文禹撷,邹少兰,林东强,等.双水相亲和萃取法从豆壳中分离过氧化物酶[J].食品科学,2004,25(7):93-96.

[9]钟芳,王璋,许时婴,等.3种脂肪氧合酶酶活测定方法[J].无锡轻工大学学报,2001,20(1):77-78.

[10]田其英,华欲飞.大豆脂肪氧合酶研究进展[J].粮食与油脂，2006(8):6-9.

[11]孟尧,金家贵,刘双凤,等.聚乙二醇/(NH4)2SO4双水相体系分离纯化α-磷酸甘油氧化酶[J].生物医学工程学杂志,2014,31(1):137-138.

[12]周晓云,傅美景.双水相体系提取脂肪酶的研究[J].浙江农业大学学报,1997,23(2):205-210.

[13]董恒涛,吴晓英.双水相体系萃取粗状假丝酵母脂肪酶的研究[J].食品工业科技,2009,30(12):209-210.

[14]张娟,王博.聚乙二醇/硫酸铵双水相体系萃取果胶酶的研究[J].陕西农业科学,2010(5):95-97.

[15]王伟涛,张海德,蒋志国,等.PEG/Na2SO4双水相萃取木瓜蛋白酶的研究[J].食品工业科技,2014(18):188-122.

[16]Sarangi B,Pattanaik D,Rathinara J K,et al. Purification of alkaline protease from chicken intestine by aqueous two phase system of polyethylene glycol and sodium citrate[J]. J Food Sci Technol,2011,48(1):36-44.

Extraction of soybean lipoxygenase by PEG/(NH4)2SO4aqueous Two-phase systems

DING Wen-wu1,CONG Lin-na2,MENG Li3,XIA Yun-kong4

(1.School of Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China;2.Shanghai Advanced Research Institute,Chinese Academy of Sciences,Shanghai 201210,China;3.Shan Dong Sntion Group Co. Ltd.,Dongying,Dongying 257500,China;4.College of life Science,Sichuan University,Chengdu 610065 ,China)

Separation of lipoxygenase directly from nonfat soybean in aqueous two-phase systems(ATPS)of polyethylene glycol/ammonium sulfate was studied. The effects of polyethylene glycol 2000(PEG2000)concentration,(NH4)2SO4concentration,NaCl concentration,and pH value on the extraction of soybean lipoxygenase were investigated in terms of partition coefficients,phase volume of both enzyme activity and recovery. Orthogonal experiment was used to further analyze and optimize the separation of lipoxygenase. The results indicated that the optimum separation conditions of single factor conditions were PEG2000 13%,(NH4)2SO415%,NaCl 1% and pH5.8. Maximum distribution coefficient and yield of lipoxygenase was 9.710 and 87.6% under the optimum separation conditions of PEG2000 13% ,(NH4)2SO417% and pH5.2 obtained by orthogonal experiment.

lipoxygenase;aqueous two-phase system;PEG;(NH4)2SO4

2014-08-21

丁文武(1980-),男,博士,讲师,主要从事生物质提取工作方面的研究。

西华大学2014年校重点科研基金项目(z1420523)；四川省教育厅一般项目(15ZB0126)。

TS201.1

B

1002-0306(2015)11-0210-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.034