谢 瑞,李 力,张明亮,黄建忠

(福建师范大学 工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心工业微生物教育部工程研究中心 生命科学学院,福建福州 350108)

杆菌肽高产菌株的诱变选育

谢 瑞,李 力,张明亮,黄建忠*

(福建师范大学 工业微生物发酵技术国家地方联合工程研究中心工业微生物教育部工程研究中心 生命科学学院,福建福州 350108)

为了选择有效的方法选育出高产杆菌肽的菌种。利用地衣芽孢杆菌FUN-BL为出发菌株,依次进行紫外线诱变和硫酸二乙酯诱变,再通过平板活性筛选法作为初筛和HPLC作为复筛,筛选出效价较高的菌株。出发菌株F0经过紫外线诱变(15W,照射距离30cm,照射时间120s)后,筛选得到高产菌株F167,效价提高了11.76%。菌株F167经过硫酸二乙酯诱变(处理浓度为2%,处理时间为90min)后,筛选得到高产菌株F2141效价提高了32.19%。将高产菌株F2141进行连续5代遗传稳定性实验,效价依次是1003.23、989.34、976.35、960.32、949.72U/mL。通过紫外线诱变和硫酸二乙酯诱变能够选育出具有遗传稳定性的高产杆菌肽的菌株。

地衣芽孢杆菌,杆菌肽,选育,诱变,HPLC

杆菌肽是一种由枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacilluslichnifarimis)产生的抗菌多肽,它能够最有效的抑制革兰氏阳性菌,却不针对生产菌株本身。由于该物质是由杆菌产生的一种多肽,因此,中文译名为“杆菌肽”[1]。其抗菌谱与青霉素基本相似,能够有效抑制多种革兰氏阳性菌以及部分革兰氏阴性菌,如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus)、链球菌(Streptococcus)、溶血性链球菌(Streptococcus),微型球菌(MicrococcusCohn)、藤黄八叠菌(Micrococcusluteus)、放线菌(Actinobacteria)等[2-4]。同时杆菌肽还可用于饲料添加剂[5],在国内外都被作为一种理想抗生素广泛应用于饲料中。

杆菌肽在医药、水产养殖业以及畜禽业有非常广阔的应用前景。例如,Lowrymiller研究杆菌肽作为新药应用于化脓性感染的皮肤[6]。杆菌肽锌在水产动物中也起到了良好的作用[7]。另外,杆菌肽与其他抗生素之间无交叉耐药性,与青霉素、链霉素、新霉素、金霉素和黏菌素等还有协同抗菌作用。这使得杆菌肽成为一种应用广泛、安全的畜禽专用抗生素[8]。在国际上也有相当多关于杆菌肽生产、提纯、成分鉴定以及生物合成机制等方面的研究和报道。但是杆菌肽的来源较少,且工业生产还不能满足市场的需求。因此,提高杆菌肽的产量非常具有理论和应用价值。本实验以地衣芽孢杆菌FUN-BL为出发菌株,依次采用物理诱变(紫外线,UV)和化学诱变(硫酸二乙酯,DES)的方法对出发菌株进行诱变选育。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 菌种 产杆菌肽的地衣芽孢杆菌FUN-BL,藤黄微球菌,福建师范大学工业微生物教育部工程研究中心保藏。

1.1.2 培养基 斜面培养基(g/L):酵母浸膏 20.0,NaCl 5.0,琼脂 20.0,pH7.5,121℃灭菌20min;种子培养基(g/L):酵母浸膏 20.0,NaCl 5.0,pH7.5,121℃灭菌20min;发酵培养基(g/L):豆粕粉 100.0,玉米淀粉45.0,花生饼粉5.0,轻质碳酸钙6.0,硫酸铵1.0,pH7.5,121℃灭菌20min;LB培养基(g/L):胰化蛋白冻10.0,酵母提取物5.0,NaCl 1.0,固体时,加入琼脂15.0,121℃灭菌20min。

1.1.3 试剂与仪器 酵母浸膏、琼脂、酵母提取粉 分析级,广东环凯微生物科技有限公司;氯化钠、硫酸铵 分析级,西陇化工股份有限公司;磷酸二氢钾、磷酸氢二钾 分析级,国药集团化学试剂有限公司;胰化蛋白胨、杆菌肽锌标准品 分析级,上海生工生物工程有限公司;硫酸二乙酯 分析级,阿拉丁试剂(上海)有限公司;豆粕粉、玉米淀粉、花生饼粉、轻质碳酸钙 工业级,福建省麦丹生物集团有限公司;甲醇、乙腈 色谱级,国药集团化学试剂有限公司。

恒温培养振荡器、恒温培养箱、超净工作台 上海智诚分析仪器有限公司;自动压力灭菌器 致微(厦门)仪器有限公司;电子天平 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;PH计 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;紫外分光光度计 Amersham Biosciences;台式高速离心机 湘仪离心机仪器有限公司;多功能台式高速离心机 美国贝克曼库尔特公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养方法 从-80℃冰箱中取出保存的菌种接种到新鲜的斜面培养基上,37℃,24h后,取斜面上的菌种一环,接种于种子培养基中(装液量为40mL/250mL三角瓶),在37℃,230r/min的转速振荡培养。

1.2.2 菌体生长曲线的确定 将以上种液过夜培养后,再以2%种液的接种量分别转入新鲜的液体种子培养基,37℃,230r/min培养。每隔2h,取一瓶种液测定吸光度,以未接种的液体种子培养基作为空白对照,绘制菌体的生长曲线。

1.2.3.1 紫外线(UV)诱变 收集对数期的菌液,6000r/min 4℃离心,弃上清,用生理盐水洗涤3次,再适当稀释,制成108CFU/mL的菌悬液。吸取5mL的菌悬液于7个灭过菌的6cm平皿中,同时放入无菌的回形针。依次将平皿按照时间序列(30、60、90、120、150、180s)置于磁力搅拌器上,距离紫外灯(15W)30cm进行照射。照射结束后,在红灯下稀释适当的倍数,取0.2mL涂板。避光,37℃,倒置培养24h。

对平板上的菌落进行计数并且计算致死率,以未经紫外照射的菌液为空白对照。挑选致死率在80%左右的单菌落于发酵培养基中,37℃,230r/min,3d。将发酵液12000r/min,4℃离心,收集上清,进行平板活性筛选,挑选水解圈较大的菌株进行HPLC复筛。

1.2.3.2 硫酸二乙酯(DES)诱变 将经UV照射后的高产菌株培养至对数生长期,制成108CFU/mL悬浮液。取菌悬液和配制好的DES于同一个EP管中,使得DES的处理浓度为2%。并依次在37℃,60r/min振荡15、30、45、60、75、90、105、120min。结束后,分别在1mL的处理液中加入0.5mL,25%的Na2S2O3溶液,终止反应。将处理液稀释适当的倍数,取0.2mL进行涂板,24h,37℃,倒置培养。将未经DES处理的菌液作为空白对照,对平板进行菌落计数和致死率的计算,接着进行初筛和HPLC复筛。

1.2.3.3 筛选方法 初筛-平板活性筛选法:按照10%的接种量接入活化后的藤黄微球菌冷却至于45℃左右的LB固体培养基,混匀,倒平板并放入无菌的牛津杯。吸取20μL上清液于牛津杯中,37℃培养24h,测定抑菌圈的直径。

复筛-HPLC法:流动相A:pH为6.0的磷酸盐缓冲液(27.2g/L的磷酸二氢钾溶液调节34.8g/L的磷酸氢二钾溶液的pH至6.0,再将此缓冲液1∶3与纯水混合均匀)，流动相B:520mL甲醇与40mL乙腈混合均匀。

色谱条件:A相∶B相=35∶65,波长254nm,柱子C185μm 4.6×250mm,进样量20μL,流速1.0mL/min,柱温。

标准曲线的绘制:将标准杆菌肽溶液分别稀释为25、50、100、150、200、250、300、350U/mL,用0.22μm的有机微孔滤膜进行过滤除菌后,进行HPLC测定,并绘制标准曲线。

1.2.3.4 突变株遗传稳定性实验 将复筛后效价较高的突变株在斜面培养基上连续进行5次传代培养,并且将每一代都接入发酵培养基,37℃,230r/min,72h。离心发酵液,取上清液进行HPLC测定。确定突变株是否具有遗传稳定性。

2 结果与讨论

2.1 出发菌株的生长曲线

由生长曲线图可以看出,地衣芽孢杆菌FUN-BL在培养到第16h,开始进入对数生长期,当菌株培养到26h时,结束了对数生长期,同时进入了生长稳定期。在实际的育种过程中,一般诱变的浓度为108CFU/mL,且采用生长旺盛的对数生长期的菌体。因为,此时的细胞不但菌浓合适,生理状态同步,而且此时的绝大多数细胞对理化因素敏感,有利于诱变的作用[9]。结合之前的分析,选择22～24h的细胞供诱变使用。

2.2 紫外诱变的筛选结果

2.2.1 照射时间与死亡率的关系 对地衣芽孢杆菌FUN-BL进行紫外诱变得到紫外致死曲线如图2所示。

图1 FUN-BL菌株的生长曲线Fig.1 The growth curve of strain FUN-BL

图2 紫外线照射时间与菌株致死率的关系曲线Fig.2 The relationship curve between strains death rate and UV radiation times

表1 菌株F0诱变突变株初筛抑菌圈直径Table 1 The inhibition zoom of mutants from strains F0

由图2可知,菌株的致死率随着照射时间的增加而增加。当照射时间为120s时,致死率达到79.98%,当照射时间为180s时,致死率已达到93.32%。由于正突变率较多出现在偏低的剂量中,而负突变率则较多地出现在偏高的剂量中,所以剂量太低起不到诱变作用,而剂量太高不易产生正突变[10]。因此,本次紫外线诱变选取照射时间为120s。

2.2.2 初筛结果 从处理时间为120s的平板中挑选99个单菌落到发酵培养基中进行液体培养,37℃,230r/min,72h。将发酵液离心,12000r/min,4℃,10min,取上清液进行抑菌实验。各菌株的抑菌直径如表1所示,通过与出发菌株FUN-BL(F0)进行对比,分别挑选抑菌圈直径较大的菌株进行进一步的HPLC复筛。挑选的菌株号为4、7、15、23、30、44、61、67、69、76、80、81、89、91、98。

2.2.3 复筛结果 进行HPLC测定以后,可以得到杆菌肽标准品色谱图(图3)和发酵液色谱图(图4)。由两张图可以看出,标准品和粗提液的各个组分吸收峰的出峰时间基本一致,因此可以利用该色谱条件进行其余样品的HPLC测定。

图3 杆菌肽标准品色谱图Fig.3 The HPLC Chromatogram of the standard of bacitracin

图4 杆菌肽发酵液色谱图Fig.4 The HPLC Chromatogram of the fermentation broth of bacitracin

通过把杆菌肽标准品依次梯度稀释,再进行HPLC测定,可以发现色谱图中各组分吸收峰的峰面积和与杆菌肽标准品成线性关系。将所有的稀释度测定后绘制杆菌肽的标准曲线,得到标准曲线的相关系数为R2=0.9955(图5)。此标准曲线可以用于对样品发酵液进行定量测定。

图5 杆菌肽锌标准曲线Fig.5 Standard curve of zinc bacitracin

根据HPLC复筛的结果(表2),可知F167(853.34U/mL)发酵产物的活性较高,较出发菌株F0(763.55U/mL)提高了11.76%。所以,选择该株菌作为下一步硫酸二乙酯诱变的出发菌株。

表2 F0诱变突变株抑菌圈直径Table 2 The inhibition zoom of mutants from strains F0

2.3 硫酸二乙酯(DES)诱变筛选结果

2.3.1 处理时间与死亡率的关系 对地衣芽孢杆菌FUN-BL进行硫酸二乙酯诱变,在处理浓度为2%的情况下,得到DES的致死曲线如图6。

图6 DES诱变时间与致死率的关系曲线Fig.6 The relationship between strains death rate and DES induced mutation times

由图6可知,控制DES的处理浓度为2%,当处理时间为90min时,对菌株的致死率达到了80%左右,考虑到正突变率较多出现在偏低的剂量中,本实验选择DES的处理时间为90min。

2.3.2 初筛结果 从处理浓度为2%,处理时间为90min的平板上分别挑选近180个单菌落到发酵培养基中进行摇瓶发酵,条件为37℃,230r/min,72h。将发酵液离心,12000r/min,4℃,10min,取上清液进行抑菌实验。各菌株的抑菌直径如表3所示,通过与菌株F167进行对比,分别挑选抑菌直径较大菌株进行进一步的HPLC复筛。挑选的菌株号为10、25、28、41、47、49、52、72、77、78、88、94、100、111、120、133、141、156、170、177。

2.3.3 复筛结果 以上是复筛效价较出发菌株F0提高达20%以上的菌株。根据HPLC复筛的结果,可知F2141(1009.33U/mL)发酵产物的活性较高,较紫外诱变后的菌株F167(853.35U/mL)提高了18.28%,较出发菌株F0(763.55U/mL)则提高了32.19%。

表4 F1诱变突变株抑菌圈直径Table 4 The inhibition zoom of mutants from strains F1

2.4 遗传稳定性

将复筛后效价较高的突变株F2141在斜面培养基上进行五次传代培养。并且将每次传代的菌株接入发酵培养基进行发酵培养。37℃,230r/min,72h。其杆菌肽的效价如表5所示。

表3 菌株F167诱变突变株初筛抑菌圈直径Table 3 The inhibition zoom of mutants from strains F167

表5 菌株F2141的传代稳定性Table 5 Study on the stability of F2141

由表5可以看出,突变株F2141具有良好的遗传稳定性,但经过5次连续的传代培养,其效价呈现了下降趋势,可能是细胞在繁殖的过程中发生自发突变造成的。

3 讨论

地衣芽孢杆菌广泛分布在自然界中,是一种优势种群,其中不同的菌株能够产生不同的抗菌素。本实验中用到的FUN-BL产生的抗菌素为杆菌肽。杆菌肽能够有效地抑制革兰氏阳性菌,主要是影响细胞壁的合成,但是这种抗性却不针对菌株本身。鉴于杆菌肽的一系列优点,同时对比了国外关于杆菌肽的研究,提高杆菌肽的产量和质量具有一定的理论和实用价值。王筱虹等为了获得高效价的红霉素,利用UV照射红色链霉菌的原生质体,获得的突变株较对照菌株效价提高225.8%。许建平等利用DES处理了枯草杆菌B826,获得了6个拮抗活性都有所提高的菌株,其中突变菌No.35具有高效的拮抗活性和遗传稳定性。李凤梅等为了获得1,3-丙二醇的高产突变株,以丁酸梭菌为出发菌株进行诱变处理,经过DES诱变,获得l,3-PD高产菌株C.but2031和C.but2046,比诱变前分别提高了104%和113%[11]。由此可以看出,经紫外线照射和硫酸二乙酯处理后,确实能够获得高产的突变株,产量较出发菌株均有较大的提高。

对菌株F2141连续进行五次传代培养,效价出现了下降趋势,原因可能是在细胞的繁殖过程中会发生自发突变,每传代一次,退化细胞的优势会更加明显,多次传代后,就呈现出了效价降低的趋势。因此,在实验过程中,要尽量控制传代的次数,并且要对菌种定期进行分纯和复壮。

4 结论

本研究以地衣芽孢杆菌作为出发菌株,根据诱变育种的原理,依次对出发菌株进行了紫外诱变和硫酸二乙酯诱变。确定其诱变条件为:紫外照射(15W,照射距离30cm,照射时间120s),硫酸二乙酯诱变(处理浓度为2%,处理时间为90min)。在上述的条件下,通过紫外诱变筛选到一株杆菌肽效价较高的菌株F167,其产量提高了11.76%。菌株F167在硫酸二乙酯的作用后,通过平板活性筛选和HPLC筛选到一株效价高且稳定性好的高产突变株F2141,其产量较出发菌株提高了32.19%。该突变株经过连续5次的遗传稳定性实验后表明具有较高的遗传稳定性,效价无明显降低,是一株性能优异的杆菌肽生产菌株。

[1]胡尚勤.杆菌肽高产的代谢调控[J].国外医药抗生素分册,2004,15(4):160-162.

[2]蔡永峰,袁德轩.杆菌肽锌在畜禽养殖中的应用及安全性[J].国外畜牧科技,2000,27(4):35-37.

[3]马文山,廖富蘋,冯雪云,等.细菌抗菌肽的研究进展及其应用[J].生物技术通报,2008(3):39-43.

[4]Raussens V,Narayanaswan V,Goormaghtigh E,et al. Hydrogen/Deuterium exchange Kinetics of apolipophorin-III in lipid-free and phosPholipid-bund states[J].J Biol chem,1999,27(4):89-95.

[5]童应凯,韦东胜.固体发酵工艺生产杆菌肽的研究[J].中国饲料,2007(7):21-23.

[6]J Lowry Miller M D,Meyer HslatkinN,MD,Balbina A Johnson A B. Local Use of Bacitracin[J].The Journal of Investigative Dermatology,1948(10):179-188.

[7]张建刚,邓波波,朱建平.杆菌肽锌在动物生产中的应用[J].江西饲料,2011(6):31-33.

[8]薛志成.杆菌肽锌在畜禽饲养中的应用[J].养殖与饲料,2006(1):23-24.

[9]诸葛健.工业微生物育种学[M].北京:化学工业出版社,2006,85.

[10]施巧琴,吴松刚.工业微生物育种学(第二版)[M].北京:科学出版社,2003,73-74.

[11]林运萍.枯草芽孢杆菌B68发酵条件及诱变选育的研究[D].海口：华南热带业大学,2006.

Mutation breeding of high-yield strain of bacitracin

XIE Rui,LI Li,ZHANG Ming-liang,HUANG Jian-zhong*

(Engineering Research Center of Industrial Microbiology,Ministry of Education,Industrial microbial fermentation technology and Area Joint National Engineering Research Center,College of Life Science,Fujian Normal University,Fuzhou 350108,China)

The purpose of this article was to select effective method to breed high-yield strains of bacitracin. UsingbacilluslicheniformisFUN-BL as an aboriginal strains,the positive mutants were screened by cup-plate method and HPLC after ultraviolet and diethyl sulfate. The aboriginal strains F0mutated through ultraviolet(15W,the irradiation distance of 30 cm and the irradiation time of 120 sec)were screened in repeat to obtain the high-yield strain of bacitracin F167 ,whose titer was improved by 11.76%. Then F167 mutated through diethyl sulfate(dealt with 2% diethyl sulfate for 90min)were screened in repeat to obtain the high-yield strain of bacitracin F2141 ,whose titer was improved by 32.19%. Making the high-yield strains F2141 do the genetic stability test for five successive generations,the titer followed 1003.23,989.34,976.35,960.32,949.72U/mL. High-yield strains of bacitracin can be bred by ultraviolet and diethyl sulfate.

Bacilluslicheniformis;bacitracin;breeding;mutation;HPLC

2014-09-17

谢瑞(1989-)，女，硕士研究生，研究方向：杆菌肽高产菌株的选育。

*通讯作者:黄建忠(1965-)，男，博士，教授，研究方向：微生物功能基因和工业酶制剂的研发。

TS201.3

A

1002-0306(2015)11-0188-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.029