孙 科,周凤侠

(1.徐州生物工程职业技术学院生物工程系,江苏徐州 221006;2.中央农业广播学校徐州分校,江苏徐州 221000)

黑曲霉XSY0607以纤维素为原料发酵生产柠檬酸培养基优化研究

孙 科1,周凤侠2

(1.徐州生物工程职业技术学院生物工程系,江苏徐州 221006;2.中央农业广播学校徐州分校,江苏徐州 221000)

通过对黑曲霉(Aspergillusniger)XSY0607液体深层发酵柠檬酸的培养基优化实验,得出如下结论:通因实验得出黑曲霉XSY0607发酵柠檬酸的最佳碳源为水稻秸秆、最佳有机氮源为蛋白胨、最佳无机氮源NH4NO3、最佳生长因子为牛肉膏。通过Plackett-Burman实验设计得到黑曲霉XSY0607发酵柠檬素的最佳培养基配方为:水稻秸秆粉6%、蛋白胨4.5%、NH4NO30.5%、牛肉膏0.75%、KH2PO40.15%、MgSO40.045%和FeSO4·7H2O 0.0015%。同时通过极差分析还可得出黑曲霉XSY0607发酵培养基中不同成分对柠檬酸发酵的影响顺序为水稻秸秆>蛋白胨>NH4NO3>KH2PO4>MgSO4>FeSO4·7H2O>牛肉膏。使用优化后的培养基进行柠檬酸发酵实验,柠檬酸产量为83.6mg/mL,较优化前产量提高了31.83%。

黑曲霉XSY0607,水稻秸秆,液体深层发酵,培养基优化

柠檬酸及其衍生物作为添加剂被广泛应用于食品、医疗、化工等行业,目前是世界上产销量最大的有机酸。近20年来我国柠檬酸发酵工业迅猛发展,年生产量约占世界柠檬酸总生产量的70%,是目前世界上最大的生产国和出口国[1]。传统的柠檬酸发酵都采用玉米、木薯等农作物带渣发酵。发酵生产柠檬酸粮食消耗占生产成本的 65%左右,由于世界范围需求量不断增加,应当不断开发探寻新的原料,从而实现我国柠檬酸发酵产业的可持续发展[2]。在“不与人争粮,不与粮争地”的原则指导下,采用糖蜜、秸秆等农副产品发酵柠檬酸成为近几年来的研究热点。目前国内外的研究主要集中在黑曲霉发酵秸秆产纤维素的研究:张福元等[3]利用玉米秸秆研究产生纤维素酶,谢宇等[4]用麸皮采用液体发酵研究发酵产纤维素酶,邬敏辰等[5]用水稻秸秆采用固体发酵纤维素酶。对于以秸秆为原料发酵柠檬酸的培养基研究几乎没有。本文通过研究实验室保藏菌种黑曲霉XSY0607利用纤维素发酵柠檬酸的培养基优化,为柠檬酸发酵工业探寻新的发酵原料提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

水稻秸秆 采自徐州市大彭镇某村,粉碎过60目筛;麸皮 市售,过60目筛;黄豆饼粉 市售,过60目筛;(NH4)2SO4、MgSO4、CaCl2、KH2PO4、ZnCl2实验室保藏,分析纯;蛋白胨、酵母膏、牛肉膏 实验室保藏,化学纯。

黑曲霉(Aspergillusniger)XSY0607 实验室保藏菌种;斜面培养基 羟甲基纤维素钠(CMC)0.5%,酵母膏0.15%,(NH4)2SO40.2%,琼脂2%,pH自然[6-7];种子培养基 水稻秸秆粉5%,小麦麸皮0.5%,(NH4)2SO40.25%,玉米粉1%,CaCl20.1%,pH自然[8];发酵培养基 水稻秸秆粉5.5%,(NH4)2SO40.16%,MgSO40.02%,蛋白胨3%,KH2PO40.2%,CaCl20.001%,ZnCl20.0002%,尿素0.02%,pH5.0[9-10]。

CS501-SP恒温水浴锅 重庆慧达实验仪器有限公司;FA1204B电子分析天平 上海精科天美贸易有限公司;LRH-70生化培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司;XSP-SG-63X显微镜 上海光学仪器厂;723N可见分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司;MP512-03精密pH计 上海精密仪器仪表有限公司;LC-100高效液相色谱 上海伍丰科学仪器有限公司;7L实验室不锈钢发酵罐 镇江贝利生物工程有限;SW-CJ-2F超净工作台 上海阳光实验仪器有限公司;TGL-18C高速台式离心机 上海安亭科学仪器厂;MLS-3780高压蒸汽灭菌锅 杭州亚旭生物科技有限公司;Ba-1旋转式摇床 江苏省金坛市环宇科学仪器厂;FCW系列超微粉碎机 青岛即墨市超微粉碎机厂 。

1.2 实验方法

1.2.1 菌株培养方法 在无菌条件下,取出保藏的菌种黑曲霉(Aspergillusniger)XSY0607,接种到斜面培养基上,30℃活化培养48h,然后转接如茄形瓶中,30℃恒温培养24h。再用无菌水洗下茄形瓶中成熟孢子,接入500mL三角瓶装有50mL种子培养基,30℃150r/min震荡培养28h。然后将种子液以10%～15%[11]的接种量转接至装有发酵培养基的7L小型不锈钢发酵罐中,通风搅拌培养[12]。每隔8h取样测定柠檬酸的产生情况和底物的消耗情况,等到黑曲霉菌丝开始自溶时终止培养,分离黑曲霉菌体和发酵液。每批次都按此方法。

1.2.2 产物分析的方法 总酸测定:取1mL经过普通滤纸过滤过的柠檬酸的发酵滤液用0.1429N的NaOH滴定,所消耗的NaOH毫升数即为总酸度。柠檬酸含量测定:采用高效液相色谱法测定柠檬酸的含量[13-15]。总糖测定:采用6mol/L的硫酸水解后,用菲林试剂法测定;还原糖测定:直接采用菲林试剂法测定。

1.2.3 发酵培养基优化

1.2.3.1 培养基成分单因素优化实验 碳源优化:分别以过60目筛的5%水稻秸秆粉、小麦秸秆粉、玉米秸秆粉、木屑和青草粉等作为碳源,进行柠檬酸发酵,以确定最佳碳源。

有机氮源优化:分别以过60目筛的5%黄豆饼粉、酵母膏、蛋白胨、玉米浆和尿素等作为有机氮源,进行柠檬酸发酵,以确定最佳有机氮源。

无机氮源优化:分别以0.5% NaNO3、(NH4)2SO4、KNO3、NH4NO3和NH4Cl作为基础培养基中的无机氮源,进行柠檬酸发酵,以确定最佳无机氮源。

生长因子优化:以牛肉膏和酵母膏作为生长因子的来源,总浓度为0.6%,分别以牛肉膏和蛋白胨之间不同比例(6∶0、5∶1、4∶2、3∶3、2∶4、1∶5、0∶6),进行柠檬酸发酵,以确定最佳无机氮源。

1.2.3.2 Plackea-Burman(简称PB)实验设计优化发酵培养基 根据发酵培养基单因素实验,影响黑曲霉XSY0607发酵生产柠檬酸的培养基因素包括:水稻秸秆粉、蛋白胨、牛肉膏、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4和FeSO4·7H2O。实验选用10因素2水平的PB实验设计,对这7个因素进行实验研究,另外3个因素作为虚拟变量,用于评估误差。实验设计的每个因素取2个水平,根据单因素实验确定的水平,同时根据常规PB实验设计要求高水平约取低水平的1.5倍。实验设计和数据分析采用SAS软件分析,每组做3个重复,结果取平均值。

2 结果与分析

2.1 培养基单因素实验

2.1.1 碳源对柠檬酸发酵的影响 由于纤维素酶是诱导酶,所以采用了五种天然的纤维素作为碳源。一可以诱导纤维素酶的产生,二可以解决发酵成本过高问题,三可以尝试为柠檬酸发酵开辟更广的原料来源。从图1可以看出:五种纤维素原料作为碳源,水稻秸秆产酸能力最强,其次是玉米秸秆,产酸能力最差的是木屑,可能是木屑中含有大量的木质素的原因。通过方差分析,水稻秸秆对柠檬酸的发酵影响极显著。所以,黑曲霉XSY0607发酵生产柠檬素最好的碳源是水稻秸秆。

图1 碳源对产酸的影响Fig.1 Effect of carbon source on production

2.1.2 有机氮源对柠檬酸发酵的影响 从图2可以看出:五种氮源对柠檬酸的产量的影响不同,蛋白胨对黑曲霉XSY0607菌株产酸能力影响最大,其次是尿素,再次是玉米浆,最后是黄豆饼粉。通过方差分析,蛋白胨对柠檬酸的发酵影响显著。所以,黑曲霉XSY0607发酵生产柠檬素最好的有机氮源是蛋白胨。

图2 有机氮源对产酸的影响Fig.2 Influence of organic nitrogen source on acid-producing

2.1.3 无机氮源对柠檬酸发酵的影响 从图3可以看出:以NH4NO3为无机氮源时,柠檬酸产量最高。通过方差分析,NH4NO3对柠檬酸的发酵影响极显著。所以,黑曲霉XSY0607发酵生产柠檬素最好的无机氮源氮源是NH4NO3。

表1 N=12的Plackett-Burman实验设计方案及实验响应值Table 1 Design and test the response value N=12 Plackett-Burman

图3 无机氮源对产酸的影响Fig.3 Effects of inorganic nitrogen sources on acid-producing

2.1.4 生长因子对柠檬酸发酵的影响 七种生长因子对柠檬酸发酵结果如图4所示。

图4 生长因子对产酸的影响Fig.4 Effect of growth factors on the acid production

从图4可以看出:牛肉膏和蛋白胨的比例不同,黑曲霉XSY0607发酵产生柠檬酸的产量差别很大,当牛肉膏∶蛋白胨为6∶0时,柠檬酸产量最大,而当牛肉膏∶蛋白胨为0∶6时,柠檬酸产生量很小。通过方差分析,0.6%的牛肉膏对柠檬酸的发酵影响显著。所以0.6%的牛肉膏是最佳生长因子。

2.2 Plackett-Burman实验设计优化发酵培养基

应用二水平的Plackett-Burman(简称PB)实验设计对发酵培养基各个组成成分:水稻秸秆粉、蛋白胨、NH4NO3、牛肉膏、MgSO4、KH2PO4和FeSO4·7H2O进行优化,确定发酵培养基各组成成分的浓度。本实验选取N=12的10因素2水平的PB实验设计方法,实验设计及结果见表1、表2和图5,其中X4、X7、X9为空白项,用于检验实验误差。根据常规Plackett-Burman实验设计要求高水平是低水平的1.5倍。

从表2可以看出:通过极差分析RX1>RX2>RX3>RX6>RX8>RX10>RX5,因此黑曲霉XSY0607发酵培养基中不同成分对柠檬酸发酵的影响顺序为水稻秸秆>蛋白胨>NH4NO3>KH2PO4>MgSO4>FeSO4·7H2O>牛肉膏。

表2 Plackett-Burman实验设计因素水平及显著性Table 2 Experimental design factors and their Plackett-Burman significance

从表2和图5可以看出:发酵培养基的组分中水稻秸秆粉、蛋白胨、牛肉膏、MgSO4和FeSO4·7H2O表现为正效应,而NH4NO3和KH2PO4表现为负效应。把每个成分的高点组合在一起就组成了黑曲霉XSY0607发酵培养基的最佳配方(%):水稻秸秆粉 6%、蛋白胨 4.5%、NH4NO30.5%、牛肉膏 0.75%、KH2PO40.15%、MgSO40.045%和FeSO4·7H2O 0.0015%。

图5 培养基各组分不同水平对发酵的影响Fig.5 Influence of components of different levels on the fermentation medium

对优化后的柠檬酸发酵培养基进行柠檬酸生产实验,做三个平行,所得的柠檬酸产量为83.6mg/mL,比初始的发酵培养基柠檬酸产量提高了31.83%。

3 结论

通过单因素实验得出黑曲霉XSY0607发酵柠檬酸的最佳碳源为水稻秸秆、最佳有机氮源为蛋白胨、最佳无机氮源为NH4NO3、最佳生长因子为牛肉膏。通过Plackett-Burman实验设计得到黑曲霉XSY0607发酵柠檬素的最佳培养基配方为:水稻秸秆粉 6%、蛋白胨 4.5%、NH4NO30.5%、牛肉膏 0.75%、KH2PO40.15%、MgSO40.045%和FeSO4·7H2O 0.0015%。同时还可得出黑曲霉XSY0607发酵培养基中不同成分对柠檬酸发酵的影响顺序为水稻秸秆>蛋白胨>NH4NO3>KH2PO4>MgSO4>FeSO4·7H2O>牛肉膏。使用优化后的发酵培养基进行柠檬酸发酵实验,柠檬酸产量达到83.6mg/mL,比用初始发酵培养基发酵柠檬酸产量提高了31.83%。

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Study on the fermentation medium optimization based on cellulose as raw material to produce citric acid byAspergillusnigerSY0607

SUN Ke1,ZHOU Feng-Xia2

(1.Department of Bioengineering,Xuzhou Engineering Vocational and Technical College,Xuzhou 221006,China;2.Xuzhou at the Central Agricultural Broadcasting School,Xuzhou 221000,China)

An optimal process about citric acid deep submerged fermentation withAspergillusnigerXSY0607 was gained as follows:the optimal culture medium was consisted with rice straw,peptone,NH4NO3and beef extract as carbon source,organic,inorganic nitrogen source and growth factor,respectively. Plackett-Burman design was applied for final culture medium of citric acid deep submerged fermentation,and the ratio of the recipe,which was consisted by rice straw,peptone,NH4NO3,beef extract,KH2PO4,KH2PO4and FeSO4·7H2O,was 6%,4.5%,0.5%,0.75%,0.15%,0.045% and 0.0015%,respectively. Range analysis showed the influence of the components to the citric acid fermentation. As a result,the effect for the fermentation,from strong to weak was rice straw,peptone,NH4NO3,KH2PO4,MgSO4,FeSO4·7H2O and beef extract. Medium was optimized using citric acid fermentation tests conducted,citric acid production was 83.6mg/mL,increasing 31.83% compared with level before optimization.

Aspergillusniger;rice straw;submerged fermentation;medium optimization

2014-07-23

孙科(1977-)，男，本科，讲师，主要从事生物发酵研究。

徐州生物工程职业技术学院2013年立项课题(2013B07)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)11-0172-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.026