何世微,陶毅明,王贵平,廖朝亮

(桂林医学院 生物技术学院,广西桂林 541004)

曲酸对菠萝蜜多酚氧化酶的抑制作用和抑菌实验

何世微,陶毅明*,王贵平,廖朝亮

(桂林医学院 生物技术学院,广西桂林 541004)

采用酶动力学和Lineweaver-Burk双倒数法作图研究了曲酸对菠萝蜜多酚氧化酶PPO的抑制作用和机理,并通过平板菌落实验研究了曲酸对果肉的抑菌效果。结果表明,曲酸对PPO酶活有很强的抑制作用,其IC50为0.297mmol/L,表现为可逆非竞争性抑制,解离常数Ki为0.296mmol/L;果肉经0.10%曲酸浸泡后6d内具有较好的抑菌效果。

曲酸,菠萝蜜,多酚氧化酶,抑制作用,抑菌

菠萝蜜(Artocarpusheterophyllus),又名树菠萝,属热带水果,在我国海南、福建、广东和广西等地广泛栽培,其果肉口感爽脆、蜜甜,富含糖类、蛋白质、维生素及各种有益微量元素,营养价值高[1]。菠萝蜜果实硕大,果壳所占体积较大,因此常以鲜切果肉、果脯等形式出售。菠萝蜜加工过程中,细胞受损,在多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)的催化下,果肉中的酚类物质被氧化成褐色或黑色的醌类物质,使果肉颜色加深,从而影响到产品的外观。菠萝蜜的护色保鲜研究工作较少,其方式主要有抗坏血酸浸泡[2]、壳聚糖涂膜[3]和复合配方浸泡[4]等。但这些方法存在某些缺点,如抗坏血酸可参与非酶促褐变、糖类涂膜容易滋生细菌、复合配方中添加剂种类多、成本高。因此使用单一、安全、有效、廉价兼抑菌的褐变抑制剂对菠萝蜜果肉进行保鲜研究具有现实意义。曲酸是微生物产生的一种弱酸性代谢物,也是目前在果蔬和食品行业中使用的一种天然保鲜剂,可抑制PPO酶活并具抑菌作用[5]。本文研究了曲酸对菠萝蜜PPO的抑制作用和机理,并观察了曲酸的实际抑菌效果。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

菠萝蜜 桂林当地市场购买的成熟菠萝蜜,果实色泽亮黄、香气浓郁、肉肥味甜;DEAE Sepharose Fast Flow、Sephacryl S-200 美国GE公司;曲酸 分析纯,成都艾科试剂公司;儿茶酚 分析纯,上海生工生物公司。

1510酶标仪 美国Thermo Fisher公司;3K15低温离心机 德国Sigma公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酶的分离纯化 称取20g菠萝蜜果肉,置于100mL预冷的0.1mol/L磷酸缓冲液中(PBS,pH7.0,含0.5%聚乙烯吡咯烷酮和少量二氧化硅),于冰上研磨,4℃静置过夜。次日研磨液4℃、10000r/min离心15min,保留上清液,用-20℃预冷的丙酮在冰盐浴下(-15℃)沉淀蛋白质。-20℃静置2h后,10000r/min,4℃离心15min,收集沉淀。蛋白质沉淀用4mL PBS重新溶解后,经DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析和Sephacryl S-200分子筛层析,最后得到纯化的PPO[6]。

1.2.2 酶活及反应初速率的测定 25℃条件下,300μL无曲酸测活体系中含50μL 0.2mol/L PBS(pH7.0)、150μL 50mmol/L儿茶酚、50μL酶液和50μL蒸馏水。反应时观察黄色产物邻醌的生成,1min后(直线范围内即反应初速率范围)测吸光值A420。每分钟吸光值增加0.001定义为一个酶活单位(U)[6]。反应初速率v以每分钟酶活单位的变化来表示,单位为U/min。

1.2.3 IC50的测定 在反应管中加入50μL 0.2mol/L PBS(pH7.0)、150μL 50mmol/L儿茶酚、3～30μL 10mmol/L曲酸母液和50μL酶液,并用蒸馏水补足至300μL,得到含不同曲酸浓度(0.1～1.0mmol/L)的反应体系。反应1min后测A420。以无曲酸测活体系中的酶活定为100%。IC50(即抑制50%酶活的曲酸浓度)通过软件SPSS 15.0回归分析求得。

1.2.4 可逆抑制的判定 在含不同浓度曲酸(0、0.1、0.2、0.4、0.6mmol/L)的测活体系中,固定儿茶酚浓度为25mmol/L,改变酶的加入体积,加入10～50μL 180μg/mL酶液,并用蒸馏水补足至300μL,得到含不同酶浓度(6～30μg/mL)的反应体系。测定各体系v。可逆抑制为一组通过原点的直线。

1.2.5 解离常数的测定 在含不同浓度曲酸(0、0.1、0.2、0.5mmol/L)的测活体系中,改变底物儿茶酚的加入体积,加入30～120μL 50mmol/L儿茶酚,并用蒸馏水补足至300μL,得到含不同底物浓度(5～20mmol/L)的反应体系。测定各体系v。以初速率的倒数1/v对底物浓度的倒数1/[S]作图,即Lineweaver-Burk双倒数法作图,得到一组直线。对于非竞争性抑制,以该组直线的各纵截距1/Vm对曲酸浓度二次作图,得一直线,其斜率为1/Vm0Ki,式中Ki为解离常数,Vm0为双倒数作图中对照(即不含曲酸的直线)的纵截距[7]。

1.2.6 PPO在曲酸溶液中的反应进程曲线 在含不同浓度曲酸(0、0.1、0.2、0.3、0.8mmol/L)的测活体系,观察黄色产物邻醌随时间的生成过程,每隔30s测A420,共测10min,以A420对时间作图[8]。

1.2.7 平板菌落计数 果肉经0%、0.05%和0.10%(w/v)曲酸溶液浸泡15min后,置8℃冰箱储藏。在处理当天(第0d,即浸泡后不储藏立即菌落培养48h)和储藏第3、6、9d,无菌操作分别取25g样品,放入装有225mL 0.86% NaCl的灭菌均质杯内,于8000r/min均质2min,制成样品匀液。匀液经104～106倍稀释后,接种在琼脂平板上,36℃培养48h后计数。结果以每克果肉上菌落形成单位(colony-forming unit,CFU)的常用对数表示,即lgCFU/g表示[9]。

2 结果与讨论

2.1 曲酸对PPO的抑制作用

不同浓度曲酸对PPO酶活的影响如图1，0.1～0.4mmol/L范围内,PPO酶活随着曲酸浓度增大迅速下降;在0.6～1.0mmol/L范围内,PPO酶活缓慢下降,表现出残余酶活,IC50为0.297mmol/L。曲酸对菠萝蜜PPO的抑制效果弱于对蘑菇PPO(IC50=0.18mmol/L)[10]的抑制效果。曲酸抑制PPO酶活可能与以下因素有关[11]:与酶结合,阻碍酶与底物结合;螯合酶活中心的铜离子;干扰酶促反应中氧的参与;将产物醌重新还原成酚。

图1 曲酸对PPO酶活的影响Fig.1 Effect of kojic acid on PPO activity

2.2 曲酸对PPO的抑制为可逆抑制

不同曲酸浓度下,反应初速率v对酶浓度作图,得到一组经过原点的直线(图2),直线的斜率低于对照(0mmol/L),且随曲酸浓度的增加而降低。依动力学规律可知,曲酸对PPO的抑制作用是可逆过程(若为不可逆抑制,则为一组不通过原点的直线,且向右平移)[7],这说明曲酸与PPO以非共价键结合,结合较弱。

图2 不同曲酸浓度下，酶浓度对酶活的影响Fig.2 Effect of PPO concentration on its activity at different concentrations of kojic acid

2.3 曲酸对PPO的抑制为非竞争性抑制

在不同浓度曲酸溶液中,改变底物儿茶酚浓度[S],以1/v对1/[S]双倒数作图(图3a),得到一组横截距相同,纵截距不同的直线。说明曲酸不影响米氏常数(Km),只影响最大反应速率(Vm),表现为非竞争性抑制。可推测在菠萝蜜PPO活性中心外,存在与曲酸相结合的调节位点,曲酸与该调节位点结合后,改变PPO酶活中心构象从而影响酶活性的大小。在非竞争性抑制中,PPO与底物结合后,可再与曲酸结合,PPO与曲酸结合后也可与底物继续结合,可以形成酶-底物-抑制剂三元复合物(ESI)。由于不同来源的PPO结构上存在差异,曲酸对PPO可表现为不同的抑制机理,如曲酸对茄子PPO[12]和里氏木霉(Trichodermareesei)PPO[13]表现为竞争性抑制。在这类抑制中,曲酸与酶活中心结合,所以底物就不能再与酶结合,即曲酸和底物之间存在竞争关系。

以1/Vm对曲酸浓度二次作图(图3b),求得曲酸与菠萝蜜PPO的解离常数Ki为0.296mmol/L,低于与小麦PPO的Ki(0.6mmol/L)[14],高于与茄子PPO的Ki(0.123mmol/L)[12]和里氏木霉(Trichoderma reesei)PPO的Ki(0.01mmol/L)[13]。解离常数Ki越小,说明抑制剂与酶结合越牢固,其抑制作用越强。

图3 曲酸与PPO解离常数的测定Fig.3 Determination of Ki of kojic acid and PPO注：a:不同浓度曲酸1/v对1/[S]作图； b:1/Vm对曲酸浓度作图。

2.4 PPO在曲酸溶液中的反应进程曲线

PPO在曲酸溶液中的酶促反应过程如图4:随着曲酸浓度的增加,酶活逐渐降低。随着反应时间的延长,进程曲线的斜率不断下降,最后趋近于一条直线(图4虚线),即达到最大反应速率Vm。Vm随着曲酸浓度的增加而降低。曲酸抑制菠萝蜜PPO的酶促反应无迟滞现象,与硫脲对槐尺蠖PPO的抑制过程相似[8],而在里氏木霉(Trichodermareesei)[13]和舞毒蛾(Lymantriadispar)PPO[15]酶促反应中,曲酸能显著延长迟滞时间,使产物的开始生成时间延后。

图4 PPO在不同浓度曲酸溶液中的反应进程曲线Fig.4 Progress curves of PPO in different concentrations of kojic acid

2.5 曲酸对菠萝蜜果肉的抑菌效果

平板菌落实验结果表明(图5):处理当天(第0d,即浸泡后不储藏立即菌落培养48h),琼脂平板(0%、0.05%和0.10%曲酸)的菌落数分别为6309、398和100CFU/g,表明曲酸浸泡处理15min即可杀死果肉表面的绝大多数细菌,菌落总数只有对照的1.5%～6.3%。从第0d到第9d,经0.05%和0.10%曲酸浸泡的果肉,菌落数均明显小于当天对照,差异显著(p<0.05),说明曲酸能显著抑制果肉上细菌繁殖。第6d,0.05%曲酸处理后菌落数与第0d对照接近,差异不显著(p>0.05),0.10%曲酸处理后菌落数仍明显少于第0d对照(p<0.05)。随着天数的增加,特别是第9d,果肉即使经过曲酸浸泡,菌落数目也明显增加,达到105～106CFU/g,与第0d对照相比,差异显著(p<0.05),说明曲酸的抑菌效果在6d内最好。曲酸可显著抑制大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的生长,这可能与曲酸形成的酸性环境和抑制DNA复制相关酶有关[5,16]。

图5 曲酸对菠萝蜜果肉的抑菌作用Fig.5 Antibacterial effect of kojic acid on jackfruit bulbs注：字母不同的组间差异显著(p<0.05)。

3 结论

曲酸对菠萝蜜PPO酶活有较强抑制作用,IC50为0.297mmol/L。曲酸对PPO表现为可逆非竞争性抑制,解离常数Ki为0.296mmol/L。0.10%曲酸对鲜切菠萝蜜有较好的抑菌效果,其抑菌效果在6d内最好。

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Inhibitory effect of kojic acid on polyphenol oxidase from jackfruit and its antibacterial experiment

HE Shi-wei,TAO Yi-ming*,WANG Gui-ping,LIAO Chao-liang

(College of Biotechnology,Guilin Medical University,Guilin 541004,China)

The inhibitory effect and mechanism of kojic acid on polyphenol oxidase(PPO)from jackfruit were studied by enzyme kinetics and Lineweaver-Burk plots. The antibacterial effect of kojic acid on jackfruit bulbs was tested by plate counting. The results showed that kojic acid significantly inhibited the enzyme activity,with an IC50of 0.297mmol/L. Kojic acid was a reversible non-competitive inhibitor,with the Kiof 0.296mmol/L. Jackfruit bulbs dipped in 0.10% kojic acid showed good antibacterial effect within 6d.

kojic acid;jackfruit;polyphenol oxidase;inhibitory effects;antibacterial

2014-07-23

何世微(1991-)，男，本科在读，研究方向：酶学。

*通讯作者:陶毅明(1981-)，男，博士，副教授，研究方向：酶学。

国家自然科学基金(31260214)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)11-0159-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.023