汤 栋,荣绍丰,管世敏,李茜茜,王敬文

(上海应用技术学院香料香精技术与工程学院,上海 201418)

氧化胁迫联合UV、DES诱变选育高产、高分子量透明质酸菌株

汤 栋,荣绍丰*,管世敏,李茜茜,王敬文

(上海应用技术学院香料香精技术与工程学院,上海 201418)

本实验以马疫链球菌MF003为出发菌,通过H2O2氧化胁迫培养、紫外辐照(UV)和硫酸二乙酯(DES)对菌株进行复合诱变,获得一株高产、高分子量透明质酸酶缺陷菌株ZD-25。经摇瓶发酵培养,该菌株透明质酸产量达到1.61g/L,相对分子量达到2.13×106u,分别比原始菌株提高了120.5%,57.8%。经过多次传代后,菌株透明质酸产量及相对分子量具有较高的稳定性。经5L发酵罐初步发酵,突变株ZD-25的透明质酸产量达到4.26g/L,相对分子量达到2.90×106u,分别比原始菌株提高了166.3%,93.3%。

氧化胁迫,复合诱变,透明质酸,马疫链球菌

透明质酸(hyaluronic acid,以下简称HA)[1]是一种均匀重复的线性粘多糖,由2000～25000个葡萄糖醛酸和N-乙酰胺葡萄糖通过β-1,3和β-1,4糖苷键交替串联得到。目前已经广泛的用于多个领域,例如医药工业方面、食品工业方面[2]。

目前HA的获取主要通过动物组织提取法及发酵法。发酵法制备HA原料较动物组织提取法具有易得、产量较高、提取方便和品质较好的优点,因此发酵法制备HA逐渐取代提取法成为趋势。用于发酵HA的菌种多为C组链球菌,主要是马疫链球菌和兽疫链球菌。但是不同的菌株在发酵产HA的量以及相对分子量方面有很大的差别,尤其是获得高分子量的HA高产菌株是急需解决的问题。一般通过物理、化学诱变可以获得比较理想的菌株。

传统的诱变选育多是依靠化学或者物理单一诱变或者化学与物理的复合诱变,很少有采用生理胁迫培养与复合诱变联合选育菌株的报道。周晓惠[3]等通过在发酵液中添加溶菌酶作为胁迫手段提高了HA的分子量。管世敏[4]等研究了氧化剂NaClO胁迫培养兽疫链球菌对HA分子量的影响,结果表明HA的分子量得到了提高。有研究称培养基中氧化剂H2O2的存在会促进链球菌分泌更多的HA,同时HA分子量也会有所提高[5]。HA是链球菌用来抵御外界环境伤害的重要屏障。当菌体生长的环境有H2O2的存在时,细胞会加强HA的分泌,通过增加细胞外荚膜的厚度与黏度来保护自我。黄金明[6]等通过LiCl结合紫外(Ultraviolet)及硫酸二乙酯(Diethyl Sulfate)进行复合诱变选育出了一株高产量、高分子量的菌株。因此本实验以马疫链球菌MF003为出发菌,首先通过对菌株进行H2O2氧化胁迫培养,筛选抵抗能力较强的菌株,再对优选菌株进行紫外、硫酸二乙酯复合诱变,从中再度筛选产量、相对分子量高的菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

紫外可见分光光度计UV-6000 上海元析仪器有限公司;高速冷冻离心机GL-21M 上海卢湘仪离心机仪器有限公司;发酵罐BIOFLO3000 NEW BRONSWICK SCIENTIFIC;乌氏粘度计D01002-025 上海笛柏实验设备有限公司。

马疫链球菌MF003 本实验室保存。

固体培养基 心脑浸粉(国产,北京陆桥技术有限责任公司)3.7%,酵母粉1%,葡萄糖0.1%,琼脂粉2%,MgSO4·7H2O20.2%。调节pH至7.0,121℃灭菌15min。

种子培养基 葡萄糖2%,酵母粉2%,MgSO4·7H2O20.2%,KH2PO40.2%,Na2HPO40.1%。调节pH至7.0,121℃灭菌15min。

发酵培养基 葡萄糖5%,酵母粉2%,MgSO4·7H2O20.2%,K2SO40.2%,NaH2PO40.6%。调节pH至7.0,121℃灭菌15min。

透明质酸钠盐筛选培养基 在上述固体培养基冷却至50～60℃时加入0.1%的透明质酸钠。

1.2 实验方法

1.2.1 菌悬液制备 参考文献[7]，将种子培养基接种,于37℃,200r/min培养16～18h后6000r/min离心10min,分别用等体积的无菌生理盐水和pH7.0的磷酸缓冲液洗涤2次,之后重新悬浮于生理盐水和pH7.0的磷酸缓冲液中。摇匀后倒入装有灭菌玻璃珠的100mL的三角瓶中(玻璃珠的数量与13mL液面齐平为宜)130r/min振荡10min,制成单菌悬液,调整细胞浓度108/mL,OD600为0.75左右。其中pH7.0的磷酸缓冲液菌悬液用于DES诱变,生理盐水菌悬液用于紫外诱变与氧化胁迫培养。

1.2.2 氧化胁迫培养 参考文献[5,8]，吸取100μL浓度为0.1%、0.2%、0.3%的H2O2溶液均匀涂布于透明质酸钠盐筛选培养基上,每个条件重复3次。将原始菌株菌悬液稀释一定的倍数后,吸取100μL涂布于透明质酸钠盐筛选培养基上,37℃培养48h。

1.2.3 紫外诱变 参考文献[9]，将1.2.2选择的菌株作为出发菌制备生理盐水菌悬液进行紫外诱变。20W紫外灯预热30min。取8mL菌悬液于直径为9cm的培养皿内,培养皿内装有灭菌搅拌子。将培养皿放在离紫外灯30cm处的磁力搅拌器上,打开紫外灯的同时,打开磁力搅拌器,分别照受20、30、40、50、60s。每个条件重复3次。将照受后的和未照受的菌悬液在暗处稀释涂透明质酸钠盐筛选培养基,37℃培养48h后进行初筛和复筛。

1.2.4 DES诱变 参考文献[10]，将1.2.2选择的菌株作为出发菌制备磷酸缓冲液菌悬液进行DES诱变。

DES诱变剂的配制:取0.5mL的DES原液置于无菌三角瓶中,用0.5mL的无水乙醇溶解,加入19mL pH7.0的磷酸缓冲液,充分振荡,立即使用。方法:取10mL菌悬液注入三角瓶中,加入DES诱变剂0.2mL,充分混匀后水浴37℃,50r/min振荡40、50、60、70、80、90min。每个条件重复3次。振荡后加0.5mL 25%硫代硫酸钠溶液中止反应,将DES处理后的和未处理的菌悬液稀释涂透明质酸钠盐筛选培养基,37℃培养48h后进行初筛和复筛。

1.2.5 UV、DES复合诱变 将1.2.3紫外诱变后得到的较优的菌株作为出发菌进行DES化学诱变。将第一次复合诱变得到的较优菌株再反复进行UV、DES复合诱变。

1.2.6 致死率计算 致死率(%)=(未处理过的平板菌落数-处理过的平板菌落数)/未处理过的平板菌落数×100。致死率一般选择80%～90%之间。

1.2.7 菌种初筛 在透明质酸钠盐筛选培养基上测量单个菌落的透明圈与直径比(HC)[11],与出发菌作对照。选择HC值小的菌株保存斜面,进行复筛。

1.2.8 菌种复筛 原始菌株与初筛后保存的菌株分别用接种环接三环于50mL发酵培养基的250mL规格的三角瓶中,37℃,200r/min摇床培养。48h测HA的产量及其相对分子量。

1.2.9 突变菌株的传代稳定性实验 参考文献[9]，将突变菌株接到固体培养基上进行培养以此作为第1代,将1代菌株再转接到种子培养基中以此作为第2代;重复上述步骤直到第10代。将每代菌株进行摇瓶实验测产量与分子量。

1.2.10 样品HA的含量测定 取发酵液1mL,加入3倍体积的无水乙醇,混匀后4℃静置1h,4000r/min离心10min。沉淀重新溶解于0.9%的NaCl溶液中。采用硫酸咔唑法[12]测定HA含量。

1.2.11 样品HA的相对分子量测定 取一定体积的发酵液,加入3倍体积的95%的乙醇,静置沉淀。重新溶解于0.9%的NaCl溶液中,用2μm的微孔滤膜抽滤,再用2倍体积95%的乙醇醇沉,沉淀用无水乙醇脱水再真空干燥,得HA粗品。

将一定量HA粗品溶解之后,用硫酸咔唑法测定HA溶液浓度计算出样品HA的纯度,然后再称取一定量的粗品HA溶解于适当量的0.9% NaCl溶液中,配成0.2g/L[13]浓度的HA溶液作为待测液。

采用Laurent[14]法测定HA的相对分子量。采用内径为0.54mm的乌氏粘度计于25℃测定黏度,参比液为0.9%的NaCl溶液。根据公式计算特性黏数:

[η]=lnηr/c,公式中ηr为T/T0,c为供试液浓度g/mL。其中T为参比液流出时间,T0为供试液流出时间。

根据公式[η]=0.036Mr0.78,计算出HA的平均分子量Mr。

2 结果与讨论

2.1 H2O2氧化胁迫培养菌株筛选

按照1.2.2的方法进行氧化胁迫培养。结果如表1所示,当H2O2的浓度在0.2%的时候,致死率达到了89.0%,从存活的菌株当中挑取HC值小的50株斜面保存。原始菌株的产量经过摇瓶实验稳定在0.73g/L左右。保存的50株菌株经过摇瓶实验发现大部分的菌株的产量相对于原始菌株都有一定的提升,其中较优的一株H-6经过摇瓶实验产量稳定在0.87g/L,相对于原始菌株提高了19.2%。其中相对分子量与原始菌株相差不大,都为1.35×106D左右。实验结果表明通过H2O2氧化胁迫培养,产量较低的菌株无法存活,而产量较高的菌株能存活可能是由于当菌株在有H2O2的环境中生长时,细胞通过分泌更多的HA来降低氧自由基的进入,从而降低活性氧对细胞的伤害[15-16]。

表1 平板菌落数Table 1 Flat number of colonies

2.2 紫外诱变菌株筛选

按照1.2.3的方法对2.1筛出的菌株H-6进行紫外诱变。结果如图1所示,照受时间在50s时,致死率为92.3%,照受时间为60s时致死率接近100%,因此选择照受时间50s为最佳时间。

图1 紫外诱变的致死曲线Fig.1 Fatality rate curve in UV mutation

将在此条件下得到的菌株选取50株进行初筛,挑取HC值较小的10株菌株,测定HA的含量和相对分子量,结果如表2所示。大部分突变菌株相对于原始菌株在产量与相对分子量方面都有一定的提高。选择一株较优的突变菌株Z-15,其产量为1.04g/L,相对于原始菌株提高了42.5%。相对分子量为1.67×106u,相对于原始菌株提高了23.7%。同时Z-15突变株可以作为下一步复合诱变的出发菌株。

表2 经紫外诱变后突变株的复筛结果Table 2 Further selection of high hyaluronic acid-producing strain by UV mutation

2.3 DSE诱变菌株筛选

按照1.2.4的方法对2.1筛出的菌株H-6进行DES诱变。结果如图2所示,DES处理时间在80min时致死率为85.3%,处理时间为90min时致死率接近100%,因此选择处理时间为80min为最佳处理时间。

图2 DES诱变的致死曲线Fig.2 Fatality rate curve in diethyl sulfate mutation

将在此条件下得到的菌株选取50株进行初筛,挑取HC值较小的十株菌株,测定HA的含量和相对分子量,结果如表3所示。突变菌株的产量跟相对分子量都有提高,其中突变菌株D-16的结果更好,其产量达到1.20g/L,相对于原始菌株提高了64.4%。相对分子量为1.75×106u,相对于原始菌株提高了29.6%。

2.4 UV、DES复合诱变菌株筛选

一般认为复合诱变具有协同作用,诱变效果要好于单一的诱变。复合诱变的致死率也是以80%～90%为宜。以紫外诱变突变菌株Z-15为出发菌,按照1.2.4的方法进行DES诱变,挑选HC值小的菌株再次进行UV与DES复合诱变,如此反复复合诱变10次。

将复合诱变的突变菌株进行初筛,部分平板实验结果如图3、图4所示,由图可以看出,出发菌株MF0039(图3),其在生长过程中产生大量的透明质酸酶,菌株周围的透明圈较大。而通过复合诱变后的菌株周围的透明圈大小有较大差异,其中一株较优良的菌株ZD-25(图4)周围基本没有透明圈出现。

表3 经DES诱变后突变株的复筛结果Table 3 Further selection of high hyaluronic acid-producing strain by diethyl sulfate mutation

图3 出发菌株MF003Fig.3 Original strain MF003

图4 复合诱变后的菌株Fig.4 Compound mutagenized strain

通过比较HC值大小,选择10株HC值较小的突变菌株进行进一步复筛,其结果如表4。经过初筛与复筛得到较优菌株ZD-25,其产量达到1.61g/L,相对于原始菌株提高了120.5%,相对分子量为2.13×106u,相对于原始菌株提高了57.8%。相对于Z-15,D-16突变株其产量与相对分子量均有所提高。因此选用ZD-25为复合诱变后的较优菌株。

2.5 ZD-25突变菌株的遗传稳定性

获得传代稳定的突变菌株也是诱变选育的目的之一,因此将突变菌株ZD-25进行10次的连续传代,每次均进行产量和相对分子量的测定。结果如图5所示。HA的产量、相对分子量基本维持在1.61g/L、2.13×106u左右。从第9代开始透明质酸的产量与相对分子量开始出现轻微的下降,但HA的产量和相对分子量的下降均在10%以内[17],因此总体上菌株还处于稳定状态。

表4 复合诱变后突变株的复筛结果Table 4 Further selection of high hyaluronic acid-producing strain by compound mutation

图5 突变株ZD-25遗传稳定性Fig.5 Genetic stability of ZD-25

2.6 初步5L发酵罐实验结果

将原始菌株与ZD-25菌株分别进行5L发酵罐初步实验。将种子液培养16h之后,按照10%的接种量无菌操作加入发酵培养基中,一共3.6L。基本参数:温度37℃,转速200r/min,pH控制在7.2,通气量3.6L/min。每隔4h取一次样,在第10h补加20g/L的糖液,测量HA的含量与相对分子量。结果如图6所示,突变株ZD-25的HA产量与相对分子量分别达到了4.26g/L,2.90×106u,分别比原始菌株的1.60g/L,1.50×106u提高了166.3%,93.3%。本实验室后期会对突变株ZD-25的发酵条件进一步优化。

图6 原始菌株与突变菌株ZD-25发酵曲线Fig.6 Fermentation diagram of original strain and mutant strain ZD-25

3 结论

实验开始先以H2O2作为筛选条件,对菌株MF003进行氧化胁迫培养,再以紫外、DES单独诱变,结果显示经过氧化胁迫培养后的HA在产量上有一定的提高,经过紫外、DES单独诱变之后,透明质酸的产量与相对分子量都有一定的提高。为了进一步选择高产菌株,因此下一步选择了以UV与DES的复合诱变,结果显示复合诱变相对于单一的诱变还是具有明显的优势的,这可能是由于复合诱变具有协同效应,能很好的对菌株进行诱变选育。经过摇瓶发酵得到的突变菌株ZD-25的产量达到1.61g/L,相对于原始菌株摇瓶发酵提高了120.5%。相对分子量为2.13×106u,相对于原始菌株提高了57.8%。经过10次的传代,仍能保持遗传稳定。说明H2O2氧化胁迫培养与复合诱变相结合的方法能提高突变几率降低回复突变率,得到良好的菌株。通过5L的发酵罐初步发酵,突变株ZD-25的HA产量达到了4.26g/L,相对分子量达到了2.90×106u,分别比原始菌株发酵罐发酵提高了166.3%,93.3%。

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Oxidative stress and UV,DES compound mutation screening of high molecular weight and high-yield hyaluronic acid strain

TANG Dong,RONG Shao-feng*,GUAN Shi-min,LI Qian-qian,WANG Jing-wen

(School of Perfume and Aroma Technology,Shanghai Institute of Technology,Shanghai 201418,China)

StreptococcusequinesMF003 was used as an original strain to perform H2O2oxidative stress culture,ultraviolet radiation(UV)and diethyl sulfate(DES)compound mutation. After screening,a hyaluronidase deficient strain ZD-25 with high molecular weight and high-yield of hyaluronic acid was achieved. Based on shake flask fermentation,the yield of hyaluronic acid reached to 1.61g/L and relative molecular weight of 2.13×106u. Compared to the original strain,the yield and relative molecular weight were increased by 120.5% and 57.8%,respectively. The production and relative molecular weight of hyaluronic acid maintained high stability after several generation of reproduction. Furthermore,the yield of hyaluronic acid in mutant ZD-25 reached to 4.26g/L and relative molecular weight of 2.90×106u by 5L fermentation tank initial fermentation. Compared to the original strain,the yield and relative molecular weight increased 166.3% and 93.3%,respectively.

oxidative stress;compound mutation;hyaluronic acid;streptococcusequines

2014-08-08

汤栋(1989-),男,在读硕士,研究方向:生物发酵与提取。

*通讯作者:荣绍丰(1969-),男,博士,教授,研究方向:天然香料与医药产品的生物技术研究。

上海市科委产学研医项目(11DZ1921405);上海市产学研合作年度计划(沪CXY-2013-78);上海应用技术学院引进人才科研启动项目(YJ2013-23)。

TS205

A

1002-0306(2015)11-0136-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.019