汪洋点点,雷 宜,张梦梅,李 元,李 智,张志清

(四川农业大学食品学院,四川雅安 625014)

响应面法优化麦麸中植酸的提取条件及植酸抑菌效果分析研究

汪洋点点,雷 宜,张梦梅,李 元,李 智,张志清*

(四川农业大学食品学院,四川雅安 625014)

以麦麸为原料,采用盐酸提取麦麸中植酸。在单因素实验的基础上,选择提取时间、提取温度、酸浸液浓度和料液比为自变量,植酸含量为指标,通过响应面法优化植酸提取的工艺条件,建立了植酸提取的二次多项式数学模型,并得到最佳工艺条件。采用牛津杯法研究了其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌的抑菌谱及最小抑菌浓度;探讨了不同浓度、金属阳离子及浓度、温度和有机溶剂对其抑菌效果的影响。结果表明:麦麸中植酸提取的最佳工艺条件为:提取时间2.2h,提取温度40℃,酸浸液浓度1.2mol/L,料液比1∶22(g/mL)。经验证在最佳提取工艺下,植酸的含量为1.215%。植酸提取液对四种细菌均有较好的抑制效果,最小抑菌浓度依次为2.17、2.89、3.61、3.61μg/mL;随着植酸提取液浓度增大,抑菌效果增强;分别与100、200、300mmol/L的氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙溶液混合,抑菌效果减弱;与10%(v/v)乙醇、丙二醇、丙三醇等有机溶剂混合后,其抑菌效果明显下降;经0、65、121℃处理后的植酸提取液的抑菌效果无明显变化。

麦麸,植酸,响应面法,提取,抑菌效果

植酸(phytic acid)又名肌醇六磷酸酯,学名称为环己六醇六磷酸酯,是淡黄色或黄褐色粘稠状液体,呈强酸性,易溶于水、乙醇、丙二醇和甘油等,几乎不溶于醚、苯、乙烷和氯仿等,遇高温则分解[1]。麦麸是制粉过程中提取小麦粉和胚芽后的残留部分,主要用作饲料,其经济附加值很低。因此,如何利用麸皮中的功能性成分成为现代食品和粮油加工的研究热点。研究表明,麦麸中含有4%～5%的植酸[2],是制取植酸的良好来源。植酸在医药、化工、纺织工业、食品等轻工业中均有广泛的用途[3]。

生产中一般采用提取法制取植酸[4-5],主要有菲丁法、萃取法和膜分离法。有关植酸含量的测定方法大致可分为酶法[6]、分光光度法[7]、现代仪器法[8-9]、比色法[10]等。近年来植酸在我国得以迅速发展,优化出经济、高效的植酸提取工艺条件,是提高产品质量及经济效益的重要环节。因此,本文以麦麸为原料,从麦麸中提取植酸,以植酸含量为指标,研究提取不同提取条件(提取时间、提取温度、酸浸液浓度、料液比)对植酸得率的影响。在单因素分析的基础上,以植酸含量为响应值,进行响应面实验优化麦麸中提取植酸的工艺条件。同时,在测定植酸提取液对食品中常见细菌最小抑菌浓度的同时,研究了其在不同条件下(浓度、金属阳离子、浓度、温度和有机溶剂)的抑菌效果,为麦麸功能的综合开发利用提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

麦麸 雅安市售;大肠杆菌(Escherichiacoli):菌株编号ATCC 25922、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus):菌株编号ATCC 25923、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis):菌株编号CICC 21482、沙门氏菌(Salmonella):菌株编号CTCC 21482均由四川农业大学食品学院微生物实验室鉴定保存。

牛肉膏、蛋白胨 均购自北京奥博星生物技术有限责任公司;氯化钠、氯化钙、琼脂、氯化镁、氯化钾、氢氧化钠、盐酸、乙醇、丙二醇、丙三醇、植酸(50%高纯度植酸液体) 均购自成都科龙化学试剂厂;0.22μm水系微孔滤膜购自郑州市国达仪器设备有限公司;一次性注射器购自杭州绍峰科技有限公司;HD-542型牛津杯购自北京杰瑞恒达科技有限公司;游标卡尺购自广州市新徕测绘仪器有限公司。

CCP225D型电子天平 德国赛多利斯股份公司;UV-3100PC型紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;KH-50B型超声波破碎仪 昆山禾创超声仪器有限公司;HH-2数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司;Thermo BR4i冷冻离心机 美国Thermo公司;SYQ-DSX-280B型手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;SW-CJ型洁净工作台 苏州安泰空气技术有限公司;HZQ-A型恒温振荡培养箱 上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 麦麸中植酸提取方法的优化

1.2.1.1 植酸含量的测定方法 参考王国蓉[11]等的方法,并做一定修改。准确称取2g粉碎后的麦麸置于250mL烧杯中,采用盐酸浸提,超声破碎15min后,置于恒温水浴锅中保温酸浸一定时间,离心(4500r/min,10min),取2mL所得植酸粗提液,用蒸馏水定容至10mL,加入2滴10%的磺基水杨酸,用硫代硫酸钠标样标定了浓度的三氯化铁溶液滴定至溶液呈紫色且30s内不褪色。植酸含量按下式进行计算。

式中:α为稀释倍数;c为三氯化铁溶液的浓度,mol/L;V为消耗三氯化铁溶液的体积,mL;0.2375为每分子植酸可络合 2.8个Fe3+,1mol 三氯化铁相当于0.2357g植酸;W为样品干基质量,g。

1.2.1.2 提取方法的优化 参考罗仓学[12]等的方法,并做一定修改。以植酸含量为指标,分别选取提取时间、提取温度、酸浸液浓度与料液比进行麦麸中植酸提取的单因素优化实验。对每个单因素进行方差分析,验证该因素是否具有显著性,具有显著性的因素入选响应面分析的因素。在单因素基础上,采用Box-Behnken中心组合设计原理,进行四因素三水平的响应面实验对植酸提取的工艺条件进行优化。采用多元二次回归方程拟合因素与响应值之间的函数关系,通过回归方程优化工艺参数,预测响应值,并对影响实验过程的因子及其交互作用进行评价,确定最佳反应条件。实验因素及水平见表1。

表1 因素水平编码表Table 1 Variables and levels in response surface design

1.2.2 植酸粗提液对食品中主要致病菌的抑菌效果分析

1.2.2.1 植酸粗提液的制备 将一定量的麦麸按1∶20的料液比加入1mol/L的HCl,超声15min后,在40℃的恒温水浴锅中保温2h,在4500r/min下离心10mim得到的上清液经旋转蒸发仪浓缩,即得到植酸粗提液,其含量为0.1444g/mL。

1.2.2.2 抑菌谱的测定 参考倪清艳[13]等的方法,挑取活化后的供试菌,接种于营养肉汤培养基中,37℃培养24h,取其培养物稀释至含菌量106～107CFU/mL,用移液枪吸取100μL的菌悬液于凝固的培养基上涂布均匀。用无菌镊子安放牛津杯,轻轻加压,使其与培养基接触无间隙,将经0.22μm滤膜过滤除菌体积分数为4%的植酸粗提液100μL加入牛津杯里,设置三个平行实验,在37℃下培养24h,用直尺测量抑菌圈直径。用相同pH的盐酸和4%标准植酸溶液替代提取液作为对照。

1.2.2.3 最小抑菌浓度(MIC)的测定 参考彭益强[14],王放银[15]等的方法,取含菌量为106～107CFU/mL菌液100μL,用无菌的涂布棒在营养琼脂平板上均匀涂布。用无菌镊子插好牛津杯,将经0.22μm滤膜过滤除菌体积分数为1.00%、1.50%、2.00%、2.50%、3.00%的植酸粗提液100μL加入牛津杯里,设置三个平行实验,在37℃下培养24h,用直尺测量抑菌圈直径。

1.2.2.4 提取液浓度对植酸抑菌效果的影响 参考谢勇[16],付慧[17]等的方法,根据供试菌的最小抑菌浓度,配制不同浓度的植酸提取液,取含菌浓度为106～107CFU/mL菌液100μL,用无菌的涂布棒在营养琼脂平板上均匀涂布。用无菌镊子插好牛津杯,将经0.22μm滤膜过滤除菌体积分数为2.50%、3.00%、3.50%、4.00%、4.50%的植酸粗提液100μL加入牛津杯里,设置三个平行实验,在37℃下培养24h,用直尺测量抑菌圈直径。

1.2.2.5 金属阳离子及浓度对植酸提取液抑菌效果的影响 参考李淑彬[18],廖爱琳[19]等的做法,配制浓度为5.78 μg/mL的植酸提取液,取1mL植酸提取液分别与1mL的100、200、300mmol/L的氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙溶液混合均匀。

取含菌量为106～107CFU/mL菌液100μL,用无菌的涂布棒在营养琼脂平板上均匀涂布。用无菌镊子插好牛津杯,将经0.22μm滤膜过滤除菌的各浓度溶液100 μL加入牛津杯里,设置三个平行实验,在37℃下培养24h,用直尺测量抑菌圈直径,以未处理的植酸提取液作为对照。

1.2.2.6 温度对植酸提取液抑菌效果的影响 参考常丽欣[20]等的方法,并做一定修改。考虑到目前常用的灭菌温度,配制浓度为5.78μg/mL的植酸提取液,分别在0、65、121℃保持20min,在无菌环境中冷却至室温。

取含菌量为106～107CFU/mL菌液100μL,用无菌的涂布棒在营养琼脂平板上均匀涂布。用无菌镊子插好牛津杯,将经0.22μm滤膜过滤除菌的各溶液100μL加入牛津杯里,设置三个平行实验,在37℃下培养24h,用尺测量抑菌圈直径,以常温下未作处理的植酸提取液作为对照。

1.2.2.7 有机溶剂对植酸提取液抑菌效果的影响 参照秦慧民[21],杨敏[22]等方法,配制浓度为5.78μg/mL的植酸提取液,取1mL提取液分别与1mL的10%(v/v)的乙醇、丙二醇、丙三醇溶液混合。

取含菌量为106～107CFU/mL菌液100μL,用无菌的涂布棒在营养琼脂平板上均匀涂布。用无菌镊子插好牛津杯,将经0.22μm滤膜过滤除菌的各溶液100μL加入牛津杯里,设置三个平行实验,在37℃下培养24h,用直尺测量抑菌圈直径,以未处理的植酸提取液作为对照。

图1 单因素条件对植酸提取量的影响Fig.1 Effect of extraction single factors on phytic acid yield from wheat bran

2 结果与分析

2.1 麦麸中植酸提取方法的优化

2.1.1 各单因素对植酸提取液中植酸含量的影响 由图1a可以看出,当提取时间从1h增加至2h时,植酸含量急剧增加,2h以后植酸含量随时间的增加呈现明显减少的趋势,可能是已提取出的植酸随着提取时间的延长发生了一定程度的氧化。因此,将2h作为最佳提取时间。由图1b可以看出,随着提取温度从30℃升高到40℃,植酸含量明显增加,温度高于40℃后植酸含量随提取温度的升高明显降低。并且在实验过程中发现,当提取温度过高时酸浸液有明显的异味,可能是麦麸在较长的提取时间内由于微生物作用而发生的发酵,40℃以后因温度太高植酸发生了氧化因而含量下降。因此,将40℃选为最佳提取温度。由图1c可以看出,植酸含量随酸浸液浓度的增大而增大,当酸浸液浓度为1.0mol/L时植酸含量达到最大值,随后植酸含量有所下降。酸浸液浓度增大降低了植酸的螯合性,但当酸浸液浓度增大到一定程度后麦麸中的其他成分如蛋白质、多糖等也被溶解出,从而再次和植酸螯合,使植酸的含量降低。因此,确定提取植酸的酸浸液的最佳浓度为1.0mol/L。由图1d可以看出,当料液比在1∶10～1∶20(g/mL)的范围内,植酸含量随料液比的增加而明显增加,但料液比增加至1∶25(g/mL)时,植酸含量增加趋势很小,随着料液比的增大植酸逐渐被完全提取出来后植酸含量不再增加。经实验表明料液比太小,麦麸中的植酸不能完全提出,当植酸完全提出后料液比的增大对其没有影响,考虑工业中提取植酸的成本等因素,因此选取1∶20(g/mL)作为提取的最佳料液比。由实验结果可以看出,最佳提取时间和提取温度与罗仓学等[12]以菜籽粕为原料的实验结果相一致,可能是因为在40℃和酸浸2h的条件下,能较大程度上将植酸提取出来并保持其稳定性,故出现最高点。同时由于所选取的原料不同,所含的蛋白质不同以及在浸提液中的溶解性不同,植酸以不同形式的复合物存在,导致酸浸液浓度和料液比的结果不同。但其变化趋势仍相一致,植酸含量随酸浸浓度的增加呈现先增后减的趋势,随料液比的增加出现先增加后趋于平缓的趋势。

2.1.2 响应面实验优化植酸提取条件 在单因素基础上,本实验采用Box-Behnken中心组合设计原理,对影响植酸提取较大的4个因素:X1(提取时间)、X2(提取温度)、X3(酸浸液浓度)、X4(料液比)采用Design Expert8.0.6软件设计四因素三水平中心实验。因素水平编码表见表1,响应面实验结果见表2。

表2 Box-Behnken实验设计及结果Table 2 Arrangement and experimental results of response surface Box-Behnken design

经Design Expert8.0.6软件对表2的结果进行分析,得到四因素与植酸含量的回归方程如下:

植酸含量(%)=1.18+0.025X1+0.026X2+0.070X3+0.057X4-0.019X1X2-0.014X1X3+0.050X1X4-0.018X2X3-0.024X2X4+0.046X3X4-0.069X12-0.11X22-0.045X32-0.14X42

2.1.3 响应面分析 由图2a、图2b可以看出,时间与料液比(X1、X4)、酸浸液浓度与料液比(X3、X4)的交互作用对植酸含量影响显著,曲线较陡,且随着其数值的增加或者减少响应值降低,响应值在中心有一个最大值。

图2 交互项显著的因素响应曲面图Fig.2 Interactive significant factors of response surface figure注:a.提取时间与料液比;b.酸浸液浓度与料液比。

表3 植酸含量的方差分析及显著性结果Table 3 Variance analysis for yield of Phytic Acid with various extraction conditions

注:*代表在α=0.05上差异显著;**代表在α=0.01上差异极显著。

表4 植酸提取液浓度对抑菌效果的影响(cm)Table 4 The influence about concentration on antimicrobial effect of phytic acid extracting solution(cm)

注：“-”表示无抑菌圈出现。对响应面和回归方程进行分析后,得到的提取植酸的最优工艺条件是:提取时间2.24h,提取温度39.73℃,酸浸液浓度1.19mol/L,料液比1∶22.02(g/mL)。考虑到实际操作的可行情况,将提取植酸的最优工艺条件修正为:提取时间2.2h,提取温度40℃,酸浸液浓度1.2mol/L,料液比1∶22(g/mL)。在此条件下进行三次验证实验,得到的植酸含量的结果为1.215%、1.177%、1.253%,平均值为1.215%,与预测值1.225%基本相符。

2.2 植酸粗提液对食品中常见细菌的抑菌效果分析

2.2.1 植酸粗提液对食品常见细菌抑菌效果初测 采用抑菌圈法分析表明植酸提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌都有较好的抑制作用,通过与标准植酸和相同pH的盐酸溶液比较发现,盐酸的抑菌圈直径最大,标准植酸样品的抑菌圈直径最小。说明植酸有抑菌作用,植酸粗提液抑菌圈直径大于植酸标准品的原因可能是提取液中含有如酚类等其他水溶性物质,也具有一定的抑菌作用,故抑菌效果强于对照组。

2.2.2 最小抑菌浓度(MIC)的测定及不同植酸提取液浓度对抑菌效果的影响 由表4可知，植酸提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度依次为2.17、2.89、3.61、3.61μg/mL，故大肠杆菌对植酸最敏感。由于大肠杆菌和沙门氏菌是革兰氏阴性菌，金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌是革兰氏阳性菌，可推测植酸对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有一定抑制作用。可以看出，在一定范围内随着植酸提取液浓度的增加，抑菌圈直径呈现增大的趋势，抑菌效果增强。并且不同菌的最佳抑菌浓度不同，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌在5.78μg/mL的浓度下抑菌效果最好，金黄色葡萄球菌和沙门氏菌在6.05μg/mL的浓度下抑菌效果最好。其原因可能是不同微生物的最适pH不同，呈强酸性的植酸提取液改变其生长环境的pH，从而影响供试菌的生长。随植酸提取液浓度的增加，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌生长环境的pH先降低后基本保持不变；金黄色葡萄球菌和沙门氏菌生长环境的pH降低。

表5 金属离子及浓度对植酸提取液抑菌效果的影响(cm)Table 5 The influence about metal cations & concentration on antimicrobial effect of phytic acid extracting solution(cm)

注:“-”表示无抑菌圈出现。

表6 温度对植酸提取液抑菌效果的影响(cm)Table 6 The influence about temperature on antimicrobial effect of phytic acid extracting solution(cm)

表7 有机溶剂对植酸提取液抑菌效果的影响(cm)Table 7 The influence about organic solvents on antimicrobial effect of phytic acid extracting solution(cm)

注:“-”表示无抑菌圈出现。2.2.3 金属离子及浓度对植酸提取液抑菌效果的影响 由表5可知,植酸提取液与不同金属离子混合后抑菌效果相较对照组均减弱。其中对大肠杆菌的抑菌效果是:含有100mmol/L Na+的植酸提取液无抑菌圈出现,K+浓度的变化对抑菌圈直径影响不大,随 Mg2+浓度增大抑菌圈直径减小,随Ca2+浓度增大抑菌圈直径增加;对金黄色葡萄球菌的抑菌效果是:含有100、200mmol/L Na+、300mmol/L Mg2+和100mmol/L Ca2+的植酸提取液无抑菌圈出现,随K+浓度增大抑菌圈直径增加;对枯草芽孢杆菌的抑菌效果是:随Na+、Ca2+浓度增大抑菌圈直径减小,随K+、Mg2+浓度增大抑菌圈直径先减后增;沙门氏菌对Na+、K+、Ca2+敏感,当加入这些离子后无抑菌圈出现,随 Mg2+浓度增大抑菌圈直径增加。可能是因为植酸具有极强的螯合性,与金属离子螯合后,改变其原来的结构或影响微生物代谢酶的活性。因此植酸提取液作为防腐剂使用在含钠、钾、镁、钙离子丰富的食品中时,应考虑其抑菌效果下降的问题。

2.2.4 温度对植酸提取液抑菌效果的影响 由表6可知,相较对照组,经0、65、121℃处理后的植酸提取液对大肠杆菌的抑菌效果减弱,0℃处理对沙门氏菌的抑菌效果略有增强,65℃处理效果减弱，121℃处理几乎没有影响;经0、65、121℃处理后的植酸提取液对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌效果基本不变。说明不同处理温度对植酸抑菌效果的影响较小。

2.2.5 有机溶剂对植酸提取液抑菌效果的影响 由表7可知,乙醇与植酸提取液混合后对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌基本没有抑制作用,丙二醇、丙三醇与植酸提取液混合后对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌都有一定的抑制效果,但相较于对照组,植酸提取液与有机溶剂混合后,抑菌效果减弱。其原因可能是植酸虽易溶于这些有机溶剂,但两者混合后,对微生物生长环境的pH改变的能力减弱,且有机溶剂也可能作为微生物的碳源及能源,使得抑菌效果不如对照组。

3 结论与讨论

本实验在单因素实验的基础上,以麦麸为原料,从麦麸中提取植酸并测定植酸含量,以植酸含量为响应值,进行响应面实验优化麦麸中提取植酸的工艺条件。优化后的提取植酸的工艺条件为:提取时间2.2h,提取温度40℃,酸浸液浓度1.2mol/L,料液比1∶22。在此优化条件下进行三次验证实验,得到的植酸平均含量为1.215%,与预测值相符,且重现性好,说明响应面法优化提取植酸的工艺结果可靠。

研究发现,麦麸植酸提取液对食品中常见的4种致病菌均有明显抑制作用,其中对大肠杆菌的抑制效果最好;植酸提取液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌的最小抑菌浓度依次为2.17、2.89、3.61、3.61μg/mL;随植酸提取液浓度增加,抑菌效果增强;当将不同浓度的Na+、K+、Mg2+和Ca2+与植酸提取液混合后,抑菌效果受到抑制;经0、65、121℃处理后的植酸提取液抑菌效果变化较小;与乙醇、丙二醇、丙三醇混合后的植酸提取液抑菌效果也受到抑制。优化后植酸平均含量低于单因素结果可能是由于麦麸的吕种或批次差异。

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Study on the optimization of extracting phytic acid from wheat bran by response surface methodology and its antimicrobial effect

WANG Yang-dian-dain,LEI Yi,ZHANG Meng-mei,LI Yuan,LI Zhi,ZHANG Zhi-qing*

(College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014 ,China)

The phytic acid in wheat bran was extracted by solution of hydrochloric acid. Based on the single factor experiment test,the extract conditions,such as extraction time,temperature,hydrochloric acid concentration and ratio of solid to liquid were investigated and optimized by response surface methodology. Then a quadratic polynomial mathematical model of phytic acid extraction was established. The antimicrobial spectrum and the minimum inhibition concentration(MIC)ofEscherichiacoli,Staphyloccocusaureus,BacillussubtilisandSalmonellawere studied by means of oxford-cup tests. Also the antimicrobial effect of phytic acid on different concentrations,metal cations and concentration,temperature and organic solvents were discussed. The results indicated that the optimal conditions were as follows:extraction time 2.2h,extraction temperature 40℃,1.2mol/L hydrochloric acid solution,ratio of solid to liquid 1∶22(g/mL). Based on the optimal conditions,the yield of phytic acid was 1.215%. The phytic acid of wheat bran could effectively inhibit the growth of bacteria. The MIC were 2.17,2.89,3.61,3.61μg/mL respectively. The antimicrobial effect becomes stronger with the concentration increasing. The antimicrobial effect of phytic acid was weakened by combination with 100,200,300mmol/L solution of NaCl,KCl,MgCl2,CaCl2and 10%(v/v)ethyl alcohol,proplene glycol,glycerine,the antimicrobial effect of phytic acid was no difference when temperature was 0,65,121℃.

wheat bran;phytic acid;response surface methodology;extraction;antimicrobial effect

2014-09-03

汪洋点点(1992-)，女，本科，研究方向：食品质量与安全。

*通讯作者:张志清(1976-)，男，博士，教授，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白质工程。

国家大学生创新性实验计划课题(1310626042)。

TS210.9

A

1002-0306(2015)11-0093-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.011