刘星星，杜雨芊，黄学勇，罗火林，方菲菲，罗丽萍，*

(1.南昌大学生命科学学院 江西省植物资源重点实验室，江西南昌 330031；2.南昌市食品化妆品监督所，江西南昌 330038)

不同贮藏时间的莲子蛋白质提取及其理化特性研究

刘星星1，杜雨芊2，黄学勇1，罗火林1，方菲菲1，罗丽萍1，*

(1.南昌大学生命科学学院 江西省植物资源重点实验室，江西南昌 330031；2.南昌市食品化妆品监督所，江西南昌 330038)

为研究莲子在陈化过程中蛋白质变化规律,本文首先通过正交实验对莲子蛋白质提取条件进行优化,再利用优化的条件,分别以不同贮藏时间的莲子为材料,提取获得莲子蛋白。采用SDS-PAGE电泳和氨基酸分析仪,研究提取蛋白质的相对分子量(Mr)组成及氨基酸组成。结果表明:莲子蛋白的优化提取条件为:pH11,料液比1∶30,提取时间2h,提取率达60.11%;随着贮藏时间的增加,莲子蛋白组成发生了一定变化,Mr在26～43ku的蛋白质含量逐渐变少;当年莲子蛋白的总氨基酸含量最高,但随着陈化过程的进行,含硫氨基酸中蛋氨酸含量下降。贮藏过程中莲子蛋白质结构等的变化是莲子陈化的主要原因之一。

莲子,陈化,SDS-PAGE,氨基酸

莲(NelumbonuciferaGaertn.)是睡莲科莲属多年生水生草本植物,是特种宿根经济植物,也是我国重要的优质特产资源[1]。莲子营养十分丰富,含有大量的蛋白质、多糖、生物碱及微量营养素[2-4],是一种老少皆宜的食疗佳品及著名的药食同源食物。

干莲子中含有约25%的蛋白质。早期研究表明蛋白质的变化并不是影响陈化大米品质的主要因素[5],因为在储藏过程中,大米总蛋白质含量基本不变。但后来发现,陈化过程中,虽然总蛋白质含量基本不变,但是其内在结构和功能特性方面发生一定的变化,比如二硫键的交联作用使得小分子量蛋白质形成大分子量蛋白质,而大分子量的蛋白质又易与淀粉结合形成复合物,影响谷物的糊化特性[6-7]。大米在陈化过程中,游离氨基酸的含量也会发生变化,比如亲水氨基酸(天冬氨酸)含量会下降,疏水氨基酸(丙氨酸)含量上升,含硫氨基酸中蛋氨酸含量下降。稻谷在贮藏过程中,由于疏水基团的暴露,亲水氨基酸的减少,使得蛋白质溶解性下降[8]。蔡联辉等[9]发现氨基酸组成对莲子的品质有着较大的影响,同时也是莲子营养品质的重要指标。

目前,国外对莲子的研究主要集中在形态解剖及提取物的抗氧作用[10]及抗性淀粉的结晶性能[11]。国内有关于莲子主要成分的测定和提取、莲子营养和功效成分、食品加工及育种等方面的研究报道[4,12-13],也有对其蛋白质及功能特性进行研究[14]。课题组对比了不同贮藏时间莲子的化学成分和功能特性变化,主要涉及直链、支链淀粉含量和淀粉颗粒、脂类氧化水解、蛋白质巯基交联形成二硫键等的变化,由此引发的协同作用导致淀粉颗粒不易糊化,造成莲子蒸煮品质下降的研究[15]。但是将莲子蛋白质单独提取出来,并研究其与陈化机理的关系还未见报道。本文以不同贮藏时间的莲子为材料,利用优化的条件提取获得其蛋白质,测定了蛋白质的相对分子量、氨基酸组成及含量,并探讨了莲子在陈化过程中蛋白质组成变化规律。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

莲子:由江西省广昌县白莲科学研究所提供,品种为“太空莲3号”。当年莲子为2013年8月收获,陈年莲子分别是2012年(贮藏一年)、2011年(贮藏两年)、2010年(贮藏三年)、2009年(贮藏四年)、2008年(贮藏五年)收获,均产于广昌县白莲科学研究所基地,经去种皮、胚芽,烘干后真空包装。分别将6个年份莲子经粉碎后过80目筛,4℃冷藏备用。实验时间为2013年9～11月。

Tris-HCl,巯基乙醇,4mol/L氢氧化钠,1mol/L盐酸,5×SDS-PAGE Loading buffer,30%丙烯酰胺混合溶液,10% AP(过硫酸铵),10% SDS,染色液,脱色液,0.1%的SDS溶液。以上试剂均为现配现用。

TEMED(N,N,N′,N′-四甲基乙二胺):电泳级生化试剂;彩色预染蛋白Marker(10～170ku:英特生物技术有限公司;无水乙醚、甲醇、冰醋酸均为国产分析纯。

Easy Chem Plus型全自动离子分析仪 北京易科泰生态技术有限公司;Hitachi L-8900型全自动氨基酸分析仪 日本日立公司;Thermo orion 410A+型pH计 美国奥立龙公司;HY-4型调速多用振荡器 国华电器有限公司;1600型离心机 上海力康仪器有限公司;DRC-1000型冻干机 上海茸研仪器有限公司;752C型紫外可见分光光度计 上海第三分析仪器厂;JA1003N型电子分析天平 上海市精密科学仪器有限公司;RH-KT/C型磁力搅拌器 德国IKA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 莲子蛋白质提取条件优化及制备 采用碱提酸沉法[16]。准确称取20g干燥脱脂莲子粉,按照一定料液比加入不同pH碱溶液,恒温水浴振荡提取后,3500r/min离心15min,收集上清液,1mol/L盐酸将其pH调至4.5,进行酸沉蛋白操作,然后在4℃的冰箱中静置过夜,收集酸沉蛋白沉淀,经去离子水洗涤后冻干。冻干粉置于-20℃的冰箱中备用,采用全自动离子分析仪测定其总含氮量,以N×6.25为粗蛋白的含量。

莲子蛋白提取率(%)=(上清液蛋白质的质量/原料莲子粉中的总蛋白质质量)×100。

选定提取液pH、料液比、提取时间3个因素作单因素实验[17],考察各单因素对蛋白质提取率的影响。在单因素的基础上,采用L9(33)正交表进行正交实验,因素水平见表1。

表1 L9(33)正交实验因素水平Table 1 L9(33)Factors and levels of the orthogonal test

1.2.2 SDS-PAGE凝胶电泳 分别称取各年莲子蛋白冻干粉2mg,加入50μL的1×Loading buffer,煮沸5min,11000×g离心20min后,取20μL上清点样,采用5%浓缩胶及12%分离胶进行垂直平板电泳分析,蛋白质质量运用Quantity One软件进行分析[18]。

1.2.3 氨基酸组成分析 分别称取各年蛋白质冻干粉各0.1g于试管中,加入10mL 6mol/L的HCl溶液,封口后放入消煮炉中,110℃水解24h,冷却后用蒸馏水定容至50mL,摇匀后用0.45μL的水相滤头过滤200μL至大口离心管中,放入60℃的烘箱里浓缩至无液体,然后加入1mL 0.02mol/L的HCl溶解,静置30min后,采用氨基酸分析仪测定氨基酸含量(除色氨酸)[9]。

2 结果与分析

2.1 莲子蛋白质提取条件正交实验结果

选取提取液pH(A)、料液比(B)、时间(C)3个因素,按L9(33)正交表进行实验。从表2可知,影响莲子蛋白提取率的因素依次为:A>B>C。最佳提取条件组合为A3B2C2,即pH11、料液比1∶30、提取时间2h。由于该组合在实验中没有出现,所以追加实验用于验证。经验证可知,在A3B2C2条件下,莲子蛋白的提取率达60.11%。根据资料[14]显示,莲子蛋白的组分包括醇溶、水溶、盐溶、酸溶和碱溶蛋白。其中盐溶蛋白占总蛋白的7.64%,而碱提酸沉法没有涉及加盐提取,因此优化提取液、料液比和提取时间水平条件后,本实验提取率仍然不高。蔡联辉等[19-20]研究发现莲子残渣蛋白主要是一些非蛋白混合物、不可溶性蛋白质组分和混溶蛋白。

2.2 莲子蛋白质的SDS-PAGE电泳

由图1 a可知,莲子蛋白Mr主要集中在10～26、34～55和95～130ku之间。直观观察可见不同贮藏时间莲子蛋白电泳条带的强弱存在较大差异,尤其是Mr在26～43ku的蛋白质含量逐渐变少,但难以发现条带数目的差异。根据相关资料[14-15,21],图1a中,相对分子量在95～130ku之间的条带应该是球蛋白,而在10～55ku可能有球蛋白、谷蛋白和酸溶蛋白。张旻等[15]发现莲子中清蛋白、谷蛋白和酸溶蛋白含量较少,球蛋白含量最高。球蛋白含有较高的酸性氨基酸和疏水性氨基酸,随着贮藏时间的延长,蛋白质变性后其空间构象也会发生变化,导致这两种氨基酸外露,影响其功能特性并加剧蛋白质变性。图谱中轻微拖尾现象可能是醇溶蛋白和谷蛋白会发生交融,产生的混溶蛋白导致[20];另一方面,在样品处理过程中,多余的脂肪未处理完全。进一步运用Quantity One软件(图1b)进行自动识别,发现2013(当年)、2012(贮藏1年)、2011(贮藏2年)、2010(贮藏3年)、2009(贮藏4年)和2008(贮藏5年)年莲子蛋白分别具有18、17、17、16、16、13条条带,条带的粗细与吸光值成正比,条带越粗,该段蛋白含量也越多。以当年莲子为参考比对相似度发现,随着贮藏时间延长,相似度分别为34.2%,33.1%,25.9%,25.2%,9.5%,总体呈现下降趋势,且以贮藏5年的莲子相似度最低。

表2 正交实验结果Table 2 Schedule and results of orthogonal test

图1 不同年份莲子蛋白质SDS-PAGE电泳图(a) 和Quantity One软件分析图(b)Fig.1 SDS-PAGE electrophoresis(a) and Quantity One software analysis chart of proteins(b) in different years lotus seeds

2.3 莲子蛋白中氨基酸含量的分析

不同贮藏时间莲子蛋白氨基酸测定结果见表3。从莲子蛋白中共检出了17种氨基酸,不同年份莲子蛋白氨基酸总量分别是4.436,3.749,4.240,3.766,4.331、4.106mmol/L,当年莲子蛋白中总氨基酸含量最多;其中必需氨基酸总量分别为0.863,0.740,0.843,0.719,0.812,0.794mmol/L。必需氨基酸和非必需氨基酸总量随着贮藏年份的增加变化趋势不明显。选用FAO/WHO成人推荐值对莲子蛋白质必需氨基酸进行分析,发现不同贮藏时间莲子蛋白中的苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸的含量远远高于FAO/WHO的推荐值。异亮氨酸的含量分别是1.32%、1.02%、1.14%、1.27%、1.36%和1.26%,近似或超过FAO/WHO的推荐值。相较其它谷物而言,莲子含有丰富的赖氨酸,故莲子可平衡谷类营养的不足,提高蛋白质的生物效用。

表3 不同贮藏时间莲子蛋白质氨基酸组成Table 3 Amino acids analysis in protein of lotus seeds

注:2013年、2012年、2011年、2010年、2009年和2008年分别代表当年、贮藏1、2、3、4、5年。同列不同字母表示显著差异(p<0.05)。“ * ”代表必需氨基酸。

3 结论

本文通过正交实验,优化了莲子蛋白质提取条件,在pH11,料液比1∶30,提取时间2h时,提取率最大达60.11%,并将其应用于不同贮藏时间莲子蛋白质的提取。对提取的莲子蛋白进行SDS-PAGE电泳及氨基酸分析。研究结果表明,随着储藏时间的增加,莲子蛋白组成在贮藏过程中发生了一定变化,Mr在26～43ku的蛋白质含量逐渐变少;当年莲子蛋白的总氨基酸含量最高,随着陈化的过程,含硫氨基酸中的蛋氨酸含量下降。研究结果对于明确蛋白质组分变化对莲子质构特性的影响,以及阐明莲子的陈化机理具有积极意义。

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Extraction and physico-chemical properties of protein from lotus seeds with different storage times

LIU Xing-xing1,DU Yu-qian2,HUANG Xue-yong1,LUO Huo-lin1,FANG Fei-fei1,LUO Li-ping1,*

(1.School of Life Science,Key Laboratory of Plant Resources in Jiangxi Province,Nanchang University,Nanchang 330031,China;2.Food and Cosmetics Supervision,Nanchang 330038,China)

Lotus seed is easy to aging during storage. To investigate the variation of the protein in aging process,lotus seeds with different storage times were as material for this study. After optimizing the protein extraction conditions by orthogonal experiment,the lotus seeds protein was obtained,and its Mr and amino acid constituents were researched by using SDS-PAGE electrophoresis and Amino Acid Automatic Analyzer,respectively. The results showed that the optimum extraction condition were pH11,solid-liquid ratio 1∶30,and extraction time 2h,the extraction rate was 60.11%. With the extension of storage time,the protein content with Mr 26～43ku reduced gradually. The total amino acid content was highest in the fresh lotus seeds,but as the aging process,the content of methionine which is one of sulphur-containing amino acid was decreased. The lotus seeds protein changed during storage,which is one of the main reasons of aging.

lotus seeds;aging;SDS-PAGE;amino acid analysis

2014-09-03

刘星星(1990-)，女，硕士研究生，研究方向：植物资源与系统植物学。

*通讯作者:罗丽萍(1972-)，女，博士，教授，研究方向：食物资源开发与利用。

江西省科技厅(20123BCB22004)；江西省教育厅(KJLD12051)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)11-0058-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.11.003