曹美丽，蒋玉蓉，阙淼琳，陈 棋，魏述英，陆国权

（浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江临安311300）

响应面设计法优化铁皮石斛总多酚的提取工艺

曹美丽，蒋玉蓉*，阙淼琳，陈 棋，魏述英，陆国权

（浙江农林大学农业与食品科学学院，浙江临安311300）

利用响应面分析方法研究铁皮石斛总多酚的最佳提取工艺及体外抗氧化性。在选取酒精浓度、料液比、温度做单因素实验的基础上，进行三因素三水平的Box-Behnken中心组合研究，建立了影响因素与总多酚之间的函数关系。获得最佳工艺条件为：乙醇浓度75%，料液比1∶40，提取温度75℃；在此最佳条件下水浴条件下浸提1 h，总多酚含量为28.01 mg/g，实验结果与模型预测值相符。铁皮石斛多酚提取物具有较强的清除对DPPH·和·OH自由基能力，其IC50（半抑制浓度）分别为526.872 μg/mL和1263.024 μg/mL。

铁皮石斛，总多酚，响应面分析，最佳工艺，抗氧化性

铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）又名黑节草、云南铁皮，属微子目，兰科多年生附生草本植物，喜在温暖、潮湿、半阴半阳的环境中生长[1-2]。其茎入药，性味甘、微寒，归胃、肾经，具有益胃生津、滋阴清热的功效[3-4]。铁皮石斛因其神奇的药用价值和保健成效，被历代古籍医书奉为“药中之上品”[5-6]。现代药理学研究表明，铁皮石斛具有抗衰老、抗肿瘤、降低血糖和提高免疫等生物活性[3，6-7]。其化学成分包括石斛多糖、氨基酸、微量元素、菲类化合物、联苄类化合物、酚酸类化合物、生物碱等[1，8-10]，大部分化合物具有酚类结构[9]，酚类化合物是铁皮石斛的药用活性成分之一[9，11]。多酚类物质属于植物的次生代谢产物，是天然抗氧化剂主要来源之一[12]。然而植物中多酚的含量受加工提取工艺，植物成熟程度，品种及储存条件等因素的影响。迄今国内外有关铁皮石斛中多酚提取方法的研究报道甚少[9，12]，本实验采用响应面设计方法优化铁皮石斛总多酚提取工艺参数，同时测定其抗氧化活性，为铁皮石斛多酚类物质的开发及探讨其更多药理作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

铁皮石斛 购自杭州胡庆余堂，药材经干燥、粉粹过80目筛选，贮存备用；没食子酸标准品和Folin-Ciocalteu’s显色剂 上海源叶生物科技有限公司；DPPH（1，1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical） 东京化成工业株式会社；无水乙醇、无水碳酸钠、硫酸亚铁、过氧化氢、水杨酸等试剂 均为国产分析纯，上海生工公司。

DHG9123A电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；TP-214电子天平 丹佛仪器有限公司；XMTD-6000恒温水浴锅 上海申胜生物技术有限公司；SHZ-DⅢ予华牌循环水真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；752PC紫外可见分光光度计 上海光谱仪器有限公司；SY-150W超声波 上海宁商超声仪有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准曲线的绘制 精确称取没食子酸标准品10.0 mg，置10 mL容量瓶中，用70%乙醇溶液溶解并定容至刻度，摇匀，得1 mg·mL-1的没食子标准溶液。分别精密量取该标准溶液0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL置于25 mL容量瓶中，用蒸馏水定容，制得质量浓度为0、4、8、16、24、32、40、48 μg·mL-1没食子酸溶液。准确移取0.2 mL稀释后的溶液，加入1 mL Folin-Ciocalteu’s显色剂，混匀，2 min后加入3 mL饱和碳酸钠（7.5%），混合均匀，在室温、避光条件下放置1 h，用分光光度计在765 nm处测定其吸光值，每个浓度做三个平行实验，以吸光值平均值为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线[13]。得Y=0.0063X-0.0052，R2=0.9991。结果表明没食子酸在浓度0～48 μg·mL-1与吸光值呈现良好的线性关系。

1.2.2 铁皮石斛总多酚的提取和得率测定 准确称取0.200 g铁皮石斛粉末置于250 mL圆底烧瓶中，加入一定浓度的乙醇溶液，在一定温度下水浴回流浸提1 h，并将浸提液进行过滤后收集。取不同条件下的提取液1 mL定容至50 mL，然后从中取0.2 mL提取物，按照标准曲线项下测定样品吸光度，计算多酚得率[9]，公式如下：

式中，c为1 mL提取液定容后的多酚得率，μg·mL-1；V为多酚提取液体积，1 mL；50为1 mL提取液定容后的体积，mL；m为铁皮石斛质量，0.2 g。

1.2.3 单因素实验 实验对提取温度、料液比、乙醇浓度进行单因素分析，分别考察这3个因素对铁皮石斛多酚提取的影响。

1.2.3.1 温度对多酚得率的影响 以体积分数80%乙醇，料液比1∶40条件下浸提1 h，考察55、65、75、85、95℃五种不同温度条件下对多酚得率的影响。

1.2.3.2 料液比对多酚得率的影响 以体积分数80%乙醇、65℃条件下浸提1 h，考察1∶20、1∶30、1∶40、1∶50和1∶60五种不同料液比条件下对多酚得率的影响。

1.2.3.3 乙醇体积分数对多酚得率的影响 以料液比为1∶40，在65℃条件下浸提1 h，考察50%、60%、70%、80%和90%五种不同乙醇体积分数条件下对多酚得率的影响。

1.2.4 响应面实验设计 根据单因素实验结果，以提取温度、料液比、乙醇浓度3个因素为自变量，多酚得率为响应值进行三因素三水平的响应面实验[14]。通过Design Expert 8.0.5软件对实验数据进行回归分析[15]，得到铁皮石斛多酚提取的最优工艺参数。因素水平分析选取见表1。

表1 中心组合实验的因子及编码值Table 1 Factors and coded value of central composite experiment design

1.2.5 DPPH·清除率的测定[16]准确称取DPPH·标准品10 mg，溶于无水乙醇中，超声5 min，充分振荡，并定容于100 mL容量瓶中，配成0.1 mg/mL DPPH储备液，置于冰箱中备用。取不同质量浓度的铁皮石斛多酚提取液2 mL，分别加入0.1 mg/mL DPPH溶液2 mL，摇匀，在黑暗中放置30 min，以无水乙醇为空白在波长517 nm处测定其吸光度A样品，用无水乙醇代替DPPH·溶液按上述方法测定吸光度A对照，用无水乙醇代替多酚提取液按上述方法测定吸光度为A空白。按下式计算DPPH·清除率并用SPSS分析软件计算其半抑制率（IC50）。

DPPH·清除率（%）=（1-（A样品-A对照）/A空白）×100

1.2.6 ·OH清除率测定[17]在试管中依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4溶液，2 mL不同质量浓度的铁皮石斛多酚提取液，2 mL 6 mmol/L H2O2溶液摇匀，静置10 min，再加入2 mL 6 mmol/L水杨酸溶液，摇匀，静置30 min，以蒸馏水为空白于波长510 nm处测定其吸光度A样品，用蒸馏水代替水杨酸按上述方法测定吸光度A对照，用蒸馏水代替多酚提取液按上述方法测定吸光度A空白。按下式计算·OH清除率并用SPSS分析软件计算其半抑制率（IC50）。

·OH清除率（%）=（1-（A样品-A对照）/A空白）×100

1.3 数据处理

单因素实验运用方差分析，响应面实验通过Design Expert 8.0.5软件对实验数据进行回归分析，清除DPPH·和·OH的测定用SPSS分析软件计算其半抑制率（IC50）。

2 结果与分析

2.1 多酚得率的单因素实验

2.1.1 温度对多酚得率的影响 由图1可知，多酚得率随着温度的增加呈现先上升后下降后趋于稳定的趋势，当提取温度为75℃时，多酚得率最高，这是由于温度的提高增加了多酚物质的溶解度降低分子之间的粘滞度，使更多的酚类物质溶出[18]。但当温度再度升高时，得率反而下降，这可能是由于高温导致了部分铁皮石斛多酚的氧化，该结果与钟怡平等[19]研究结果大致一致。

图1 提取温度对多酚得率的影响Fig.1 Effect of temperature on the extraction yield of polyphenols

2.1.2 料液比对多酚得率的影响 由图2可见，随着料液比的增大多酚得率提高，当料液比为1∶40时多酚得率达到最高，再继续增大时呈下降趋势。这可能是因为料液比为1∶40时，溶剂对多酚的溶解已经达到了饱和，继续增大溶剂用量，并不能显著提高多酚的提取量，因此选最佳液料比为1∶40。

图2 料液比对多酚得率的影响Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the extraction yield of polyphenols

图3 乙醇浓度对多酚得率的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of polyphenols

2.1.3 乙醇体积分数对多酚得率的影响 由图3可知，多酚得率随乙醇浓度的增加呈现先略微下降后上升再下降的趋势，这可能是铁皮石斛多酚结构比较复杂，溶剂极性过大或过小对总酚提取均有一定影响。从本实验结果来看，当乙醇浓度为80%时，提取率达最大值。

2.2 响应面优化实验结果分析

2.2.1 响应面实验安排及实验结果 应用Design-Expert 8.0.5对表2中的数据进行二次多元回归拟合，得到提取温度X1、料液比X2、乙醇浓度X3与铁皮石斛总多酚之间的二次多项回归方程为：Y=28.14+ 0.63X1+1.14X2-1.38X3+1.05X1X2-0.59X1X3+0.95X2X3-3.06X12-2.75X22-1.96X32

由表3回归方差显著性检验表明，一次项温度（X1）对总多酚产量的线性效应不显著，料液比（X2）和乙醇浓度（X3）对多酚产量的显性效应极显著；二次项温度（X12）、料液比（X22）和乙醇浓度（X32）对总多酚产量的曲面效应均极显著；比较各因子间温度和乙醇浓度（X1X2）、料液比和乙醇浓度（X2X3）交互作用显著。在本实验设计范围内回归方程显著性检测p＜0.01极显著，该模型的调整复相关指数R2Adj=0.9705，说明该模型能解释97.05%响应值的变化，即该模型与实际实验拟合良好，实验误差小，证明应用响应曲面法优化的提取工艺提取铁皮石斛总多酚是可行的。

表2 中心实验设计及实验结果Table 2 Design and results of central composite experiment

表3 回归模型的方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

图4 温度和料液比对总多酚提取得率影响的响应面图Fig.4 Response surface of multualinfluence of extraction temperature and material to liquid ratio on extraction rate of polyphenols

图5 温度和乙醇浓度对总多酚提取得率影响的响应面图Fig.5 Response surface of multualinfluence of extraction temperature and ethanol concentraction on extraction rate of polyphenols

图6 料液比和乙醇浓度对总多酚含量影响的响应面图Fig.6 Response surface of multualinfluence of extraction material to liquid ratio on extraction rate and ethanol concentration of polyphenols

2.2.2 各因素的交互作用 响应曲面图可以形象的描述各因素之间的交互作用，如图4～图6所示。等高线的形状可以反映因素间交互作用的强弱，图形趋向椭圆且椭圆轴线与坐标轴的角度越大，则交互作用越明显，反之交互作用越弱[13]，交互项温度和料液比（X1X2）、料液比和乙醇浓度（X2X3）显著，温度和乙醇浓度（X1X3）不显著。表明各因素对多酚的提取率存在交互影响，而不是简单的线性关系。

2.2.3 最佳提取工艺的优化及验证 为验证铁皮石斛总多酚提取模型方程的适用性，对回归方程求导，并令其等于零，可以得到曲面的最大点，即三个主要因素的最佳水平值，分别为：温度76.53℃，料液比1∶42.05，乙醇浓度76.31%，在此条件下，多酚得率为28.51 mg/g。为检验实验结果是否可靠，根据最优条件进了验证实验，为方便实际操作，选取温度75℃，料液比1∶40，乙醇浓度75%，在此条件下进行三次平行实验。计算多酚得率，求其平均值为28.01 mg/g，实际与预测的多酚量较为接近，充分验证了所建模型的正确性，说明响应面分析方法适用于铁皮石斛总多酚的提取工艺的优化。

2.3 铁皮石斛多酚抗氧化活性实验

2.3.1 对DPPH·的清除作用 DPPH·是一种稳定的自由基，在有机溶剂中呈紫色，在517 nm波长处有较大吸收，当加入抗氧化剂时，一部分自由基被清除掉，使该波长下吸收强度减弱，可借此来评价某物质的抗氧化性[12]。以VC作为阳性对照，铁皮石斛对DPPH·的清除作用见图7。由图7可知，铁皮石斛对DPPH·表现出较强的清除作用，清除能力与其浓度呈正相关。在200～1200 μg/mL浓度范围内，随着多酚浓度的增加，对DPPH·的清除能力显著增强。但通过SPSS软件计算铁皮石斛和VC的IC50值分别为526.872 μg/mL和159.2592 μg/mL，可知铁皮石斛对DPPH·的清除能力仍低于VC。

图7 VC和铁皮石斛对DPPH自由基的清除作用Fig.7 DPPH radical-scavenging capability of vitamin C and polyphenols from Dendrobium officinale

2.3.2 对羟基自由基（·OH）的清除作用 以VC作为阳性对照，铁皮石斛多酚对·OH的清除作用见图8。由图8可知，铁皮石斛多酚具有较强的羟基自由基清除能力，随着浓度的增加，其清除·OH的能力进一步增强。但通过SPSS软件计算铁皮石斛和VC的IC50值分别为1263.024 μg/mL和542.003 μg/mL，可知铁皮石斛对·OH的清除能力仍低于VC。

图8 VC和铁皮石斛多酚对·OH的清除作用Fig.8 ·OH radical-scavenging capability of vitamin C and polyphenols from Dendrobium officinale

3 结论

采用响应面分析法提取铁皮石斛总多酚的工艺条件进行优化，获得最佳提取工艺条件：提取温度75℃，料液比1∶40，乙醇浓度75%，在此条件下铁皮石斛多酚得率为28.01 mg/g，这种提取具有方法简单提取效率高等优点，是一种较理想的提取铁皮石斛多酚的方法。铁皮石斛多酚可有效清除DPPH自由基和羟基自由基（·OH），其清除两种自由基的IC50值分别526.872 μg/mL和1263.024 μg/mL，在天然抗氧化剂等领域具有较好的开发潜力。

[1]李娟，李顺祥，黄丹，等.铁皮石斛资源、化学成分及药理作用研究进展[J].科技导报，2011，29（18）：74-79.

[2]聂少平，蔡海兰.铁皮石斛活性成分及其功能研究进展[J].食品科学，2012，33（23）：356-361.

[3]李桂锋，李进进，许继勇，等.铁皮石斛研究综述[J].中药材，2010，33（1）：150-153.

[4]陈晓梅，王春兰，杨峻山，等.铁皮石斛化学成分及其分析的研究进展[J].中国药学杂志，2013，48（19）：1634-1640.

[5]吕圭源，颜美秋，陈素红.铁皮石斛功效相关药理作用研究进展[J].中国中药杂志，2013，38（4）：489-493.

[6]吴昊姝，徐建华，陈立钻，等.铁皮石斛降血糖作用及其机制的研究[J].中国中药杂志，2004，29（2）：160-163.

[7]李玲，邓晓兰，赵兴兵，等.铁皮石斛化学成分及药理作用研究进展[J].肿瘤药学，2011，1（2）：90-94.

[8]管惠娟，张雪，屠凤娟，等.铁皮石斛化学成分的研究[J].中草药，2009，40（12）：1873-1876.

[9]李娟，麻晓雪，李顺祥，等.铁皮石斛中总酚的含量测定[J].中国实验方剂学杂志，2013，19（24）：60-62.

[10]Li Y，Wang YJ，Guo SX，et al.Three new bibenzyl derivatives from Dendrobium candidum[J].Chemical& Pharmaceutical Bulletin，2009，57（2）：218-219.

[11]李燕，王春兰，王芳菲，等.铁皮石斛中的酚酸类及二氢黄酮类成分[J].中国药学杂志，2010，45（13）：975-980.

[12]黄琴，沈杨霞，张成静，等.铁皮石斛多酚和黄酮含量及与抗氧化性活性的相关性[J].应用与环境生物学报，2014，20（3）：438-442.

[13]郭涛，马重华，王雅，等.响应面优化南瓜果肉多酚提取工艺及抗氧化性能研究[J].食品工业科技，2012，33（7）：315-396.

[14]王茂生，梁俊玉，高莹，等.响应面法优化超声辅助提取核桃叶多酚的工艺研究[J].食品工业科技，2012，33（7）：311-314.

[15]易军鹏，朱文学，马海乐，等.牡丹籽油超声波辅助提取工艺的响应面法优化[J].农业机械学报，2012，33（7）：311-314.

[16]苏晓雨，王振宇.红松种子壳多酚物质的提取及抗氧化特性[J].农业工程学报，2009，25（1）：198-203.

[17]徐怀德，闫宁环，陈伟，等.黑莓原花青素超声波辅助提取优化及抗氧化性研究[J].农业工程学报，2008，24（2）：264-268.

[18]Wu T，Yan J，Liu R，et al.Optimization of microwaveassisted extraction of phenolics from potato and its downstreamwaste using orthogonal array design[J].Food Chemistry，2012，133（4）：1292－1298.

[19]钟怡平，夏道宗，黄岚，等.莲房多酚提取工艺优化及其抗氧化活性研究[J].食品工业科技，2015，36（6）：235-239.

Optimization of extraction of total polyphenols from Dendrobium officinale by response surface methodology

CAO Mei-li，JIANG Yu-rong*，QUE Miao-lin，CHEN Qi，WEI Shu-ying，LU Guo-quan
（School of Agricultural and Food Science，Zhejiang A&F University，Lin’an 311300，China）

The optimum extraction conditions of total polyphenols from Dendrobium officinale by response surface methodology，as well as their antioxidant activities in vitro，were studied in the research.The experiment method was designed according to Box-Behnken central composite design with 3 factors and 3 levels on the basis of single-factor experiment of ethanol concentration，material-to-liquid ratio and temperature.The relationship between influencing factors and response values was subsequently established.The results indicated the optimum extraction conditions were as follows：the extracting solvent was 75%ethanol，material-to-liquid ratio was 1∶40，extracting temperature was 75℃，and extracting time was 1 h.Under these conditions，the maximal yield of total polyphenols reached 28.01 mg/g，which was well matched with the predicted content.Moreover，the polyphenols extracted from Dendrobium officinale exhibited an effective scavenging effect on DPPH·and ·OH free radicals，and its IC50（half inhibitory concentration）was respectively up to 526.872 μg/mL and 1263.024 μg/mL.

Dendrobium officinale；total polyphenols；response surface methodology；the optimum extraction；antioxidant activity

TS201.1

B

1002-0306（2015）22-0272-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.048

2015－03－04

曹美丽（1993-），女，大学本科，研究方向：植物种质创新，E-mail：8047107202@qq.com。

*通讯作者：蒋玉蓉（1974-），女，博士，讲师，研究方向：植物分子育种和种质创新研究，E-mail：yurongjiang746@126.com。

国家自然科学基金资助项目（31301372）；浙江省重大科技专项计划项目（2011C12030）。