李 甜，朱新荣，张 建，田童童

（石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

新疆新春36号黑小麦中硒的分布及富硒蛋白提取工艺研究

李 甜，朱新荣*，张 建*，田童童

（石河子大学食品学院，新疆石河子832000）

为了探究新疆新春36号黑小麦中硒的分布，本实验通过单因素及响应面分析法对硒蛋白、硒多糖、硒核酸及不同溶解性的硒蛋白做了系统考察。结果表明：36号黑小麦中硒蛋白、硒多糖及硒核酸中硒的含量分别为（240.52± 0.3）、（32.45±0.21）、（4.65±0.05）mg/g；碱溶性、水溶性、醇溶性和盐溶性硒蛋白的含量分别为（146.21±0.3）、（41.52± 0.6）、（19.40±0.06）、（13.65±0.12）mg/g。碱溶性硒蛋白的最佳提取条件为：NaOH溶液浓度0.17 mol/L，酸化pH4.7，（NH4）2SO4饱和度为66.0%，料液比为1∶10。该条件下模型预测碱溶性硒蛋白的提取率为76.5593%，实际实验值为76.7%。

硒蛋白，分布，提取率

硒元素是人体必需的常量矿物质营养素，在保健和预防疾病方面具有非常重要的作用[1]。当硒缺乏的时候，就很容易导致人体免疫能力下降，威胁人类健康。生命的四十多种疾病都与人体缺硒有关，如克山病、大骨病、癌症、心血管病、生殖系统疾病等症状[2-5]。植物是人类最直接的、最广泛的食物来源，也是自然界中硒循环的重要载体，且植物硒的生态效价高于动物硒，所以植物有机硒成分的分离及其生物活性等各方面也得到了广泛的研究[6]。

元素硒于1817年被瑞典化学家Berzelius发现[7]。然而从第一个硒蛋白被发现以来，生物学和医学界的科研人员通过不懈努力，已经陆续发现并确认多种硒蛋白。并且最近几年，从富硒灵芝、食用菌、烟草中提取硒蛋白或者含硒蛋白的相关研究成果在国内一些科研杂志中报道[8-11]。

然而，小麦是世界上主要的粮食作物之一，也是最有效的硒积累作物和含硒食物来源。新疆新春36号是新疆生产建设兵团第十三师农业科学研究所历时10年选育而成的新疆内第1个黑小麦新品种。该品种生长旺盛，抗病、抗倒，微量元素含量丰富，营养价值高，产值比普通春小麦高。其中硒含量为95 mg/g，处在世界平均水平（20～150 mg/g）中上之间，因此，新疆新春36号黑小麦是寻找硒蛋白的良好资源[12-13]。

目前国内外对新春36号黑小麦的研究主要集中在对其特征特性及栽培技术方面的研究，有关新春36号黑小麦硒的分布情况和蛋白质提取的研究很少，因此，本课题以新疆新春36号黑小麦为研究对象，利用响应面分析法优化碱溶性硒蛋白的提取工艺，并且对优化的工艺参数进行实际实验考察以验证响应面模型的正确性。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新春36号黑小麦 新疆生产建设兵团第十三师农科所提供；氯化钠、氢氧化钠、三氯甲烷、正丁醇、盐酸、无水乙醇、95%乙醇、硫酸铵、冰乙酸等 均为分析纯。

85-1磁力搅拌器 江苏金坛市医疗仪器厂；FZ-6粉碎机 上海百丰粉碎食品机械有限公司；BL-206-II高速冷冻离心机 上海安亭科技仪器厂；BS210S精密电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；HSG-IIC4恒温水浴锅 江苏省金坛市仪器制造有限公司；PHS-3C精密酸度计 上海精密科学仪器有限公司；DL-1电子万用炉 北京市永光明医疗仪器厂；2000D超纯水器 北京长风仪器仪表公司；BSC-3L冷冻干燥机 上海爱朗仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原料处理 新疆新春36号黑小麦颗粒用粉碎机粉碎成粉末，过60目筛备用。

1.2.2 单因素实验 称取粉碎后的黑小麦样品10 g，加入100 mL 0.10mol/L NaOH溶液，室温下搅拌提取4 h，滤液经乙酸（HAc）酸化至pH为4.5后添加（NH4）2SO4至饱和度为50%，4℃静置12 h，3000×g离心20 min，离心沉淀溶解在0.1 mol/L NaOH溶液中，Tris-HCl（pH8.0）缓冲液中4℃透析24 h，真空冷冻干燥得到碱溶性硒蛋白样品。

控制其他条件不变，选取NaOH溶液浓度、酸化pH、（NH4）2SO4饱和度、料液比和提取时间作为五个单因素进行实验。将NaOH溶液分别设定为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25 mol/L 5个不同浓度梯度，酸化pH设定为4.1、4.3、4.5、4.7、4.9不同梯度，（NH4）2SO4饱和度分别设定为30%、40%、50%、60%、70%的5个不同水平，料液比分别设定为1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12不同水平，提取时间分别设定为1、2、3、4、5 h不同水平，所有的实验进行3次平行实验。

1.2.3 响应面分析实验设计 应用Design-Expert 8.05软件，根据Box-Bbehnken中心组合设计原理，以碱溶性硒蛋白的提取率为响应值，在单因素实验结果的基础上，对NaOH溶液浓度、酸化pH、（NH4）2SO4饱和度和料液比值四个因素进行响应曲面实验设计，采用Box-Behnken设计方法来优化碱溶性硒蛋白质的提取工艺条件。

表1 响应曲面实验设计因素水平表Table 1 The range of independent variables and their corresponding levels

1.3 测定指标与方法

硒蛋白、硒多糖、硒核酸、水溶性硒蛋白、盐溶性硒蛋白、醇溶性硒蛋白及碱溶硒蛋白的含量测定依据已报到的文献[14-15，17-18]。硒含量及硒蛋白中氨基酸含量的测定参考林向成[19]和Yeo JK[16]报道的方法。

1.4 碱溶性硒蛋白提取率的计算

碱溶性硒蛋白提取率（%）=碱溶性硒蛋白的提取量/黑小麦样品的质量×100

1.5 数据处理与统计分析

用Origin 7.5软件进行数据处理，并且用SPSS 17.0统计软件进行差异显著性分析（p≤0.05），所有实验至少重复三次。

2 结果与分析

2.1 新疆新春36号黑小麦各组分中硒的分布

表2 新疆新春36号黑小麦各组分中硒的分布结果Table 2 Se’s distribution in group of the Triticale of Xinchun No.36 in Xinjiang province

从表2可以得知，新春36号黑小麦中硒的分布情况为硒蛋白（240.52±0.3）mg/g、硒多糖（32.45± 0.21）mg/g、硒核酸（4.65±0.05）mg/g。

表3 硒在新疆新春36号黑小麦蛋白中的分布情况Table 3 Distribution of Se in protein-bound of the Triticale of Xinchun No.36 in Xinjiang province

2.2 硒在新疆新春36号黑小麦蛋白中的分布

由表3可以得知，新春36号黑小麦中硒在不同蛋白中的分布情况为碱溶性蛋白（146.21±0.3）mg/g、水溶性蛋白（41.52±0.6）mg/g、醇溶性蛋白（19.40± 0.06）mg/g、盐溶性蛋白（13.65±0.12）mg/g。

表4 硒蛋白中各种氨基酸含量Table 4 The contents of amino acids in selenoprotein

2.3 硒蛋白中各种氨基酸含量的测定

由表4可知，新疆新春36号黑小麦硒蛋白中氨基酸种类丰富，其中，赖氨酸的含量在所有氨基酸中最高，达到9.58%左右，而胱氨酸的含量为0，这可能是由于小麦中的硒取代了胱氨酸中的硫而生成硒代胱氨酸或者硒代半胱氨酸[20]，从而导致了胱氨酸的含量为0。

2.4 单因素实验

2.4.1 NaOH溶液浓度对碱溶性蛋白提取的影响 由图1可知，黑小麦中碱溶性硒蛋白的含量随着NaOH溶液浓度的增大而增大，当NaOH溶液浓度为0.15 mol/L时，黑小麦中碱溶性硒蛋白的提取率达到最高，能达到77.5%。实验过程中，NaOH溶液浓度不能太高，这是因为当NaOH溶液浓度超过0.25 mol/L时，NaOH溶液和黑小麦粉末的混合溶液会变得很粘稠，对实验操作带来很大的影响，并且黑小麦中的蛋白质会很可能发生变性，蛋白质分子遭到破坏，导致蛋白质提取率明显降低。综合考虑，单因素实验中制备碱溶性硒蛋白的最佳NaOH溶液浓度为0.15 mol/L。

图1 NaOH溶液浓度对碱溶性蛋白提取的影响Fig.1 Effect of concentration of NaOH on extraction of alkali-soluble selenoprotein

2.4.2 酸化pH对碱溶性蛋白提取的影响 由图2可知，随着酸化pH不断升高，碱溶性硒蛋白的提取率也随之升高，当pH达到4.7时，新春36号黑小麦中的碱溶性硒蛋白的提取率最大，达到78.5%；但当酸化pH大于4.7时，碱溶性硒蛋白的提取率呈现出略微下降的趋势。这可能是因为高酸性水解液使得硒蛋白的结构解聚从而使其富集而发生沉淀现象，从而使蛋白的提取率呈现出不断升高的趋势。然而在pH为4.7时提取率达到最大，这是因为硒蛋白的等电点大概在此附近。另外，当pH大于4.7时，硒蛋白在此水解条件下的溶解性可能最差，因此其提取率随之下降。综合考虑，单因素实验中制备碱溶性硒蛋白的最佳酸化pH为4.7。

图2 酸化pH对碱溶性硒蛋白提取的影响Fig.2 Effect of acid pH on extraction of alkali-soluble selenoprotein

2.4.3 （NH4）2SO4饱和度对碱溶性蛋白提取的影响由图3可知，黑小麦中碱溶性硒蛋白的含量随着（NH4）2SO4饱和度增大而增大，当（NH4）2SO4饱和度为60%时，碱溶性硒蛋白的提取率达到最大，能达到73.5%；当（NH4）2SO4饱和度继续增大时，碱溶性硒蛋白的提取率没有明显的变化。这可能是因为碱溶性硒蛋白在（NH4）2SO4饱和度为60%的条件下溶解性较差，所以被析出；当（NH4）2SO4饱和度继续升高时，蛋白的析出量已达到最大，此时（NH4）2SO4饱和度对蛋白析出的影响不显著。因此，制备碱溶性硒蛋白的（NH4）2SO4饱和度为60%时提取效果最好。

图3 （NH4）2SO4饱和度对碱溶性硒蛋白提取的影响Fig.3 Effect of saturation of（NH4）2SO4on extraction of alkali-soluble selenoprotein

2.4.4 料液比对碱溶性蛋白提取的影响 由图4可见，随着料液比的升高，黑小麦中碱溶性硒蛋白的提取率逐渐增大。当料液比越低时，黑小麦粉末样品与NaOH溶液的混合液粘度越大；当料液比为1∶10时，碱溶性硒蛋白的提取率最大，达到70.3%；在料液比大于1∶10时，随着加NaOH溶液量的增加，碱溶性硒蛋白的提取率变化不大。这可能是由于在料液比较低时，样品达到最大溶解度，但是样品并未全部溶解到NaOH溶液中，造成了样品的浪费；而当料液比大于1∶10时，所加样品在NaOH溶液中充分溶解，部分NaOH溶液未起到提取的作用，造成药品浪费。综合考虑，单因素实验中制备碱溶性硒蛋白的最佳料液比为1∶10。

图4 料液比对碱溶性硒蛋白提取的影响Fig.4 Effect of the ratio of solid to liquid on extraction of alkali-soluble selenoprotein

2.4.5 提取时间对碱溶性蛋白提取的影响 由图5可见，提取时间在1～3 h之间时，黑小麦中碱溶性硒蛋白的含量随着提取时间的增加而增加；当提取时间超过3 h时，碱溶性硒蛋白的提取率随着提取时间增加没有显著变化。产生这种现象的原因可能是提取时间太短，对蛋白的提取不充分；而提取时间过长时，对蛋白的提取已达到最高水平，继续提取只是时间的浪费。综合考虑，单因素实验中提取碱溶性硒蛋白的最佳提取时间为3 h。

图5 提取时间对碱溶性硒蛋白提取的影响Fig.5 Effect of extraction time on extraction of alkali-soluble selenoprotein

2.5 响应面分析实验结果

以NaOH溶液浓度（A）、酸化pH（B）、（NH4）2SO4饱和度（C）、料液比（D）为响应变量，以碱溶性硒蛋白提取率为响应值，利用Design-Expert 8.05软件，通过表5中实验数据进行多元回归拟合，获得碱溶性硒蛋白的提取率多元线性回归方程：

表5 Box-Behnken实验设计及结果Table 5 Box-Behnken experimental design and results

Y=73.84＋5.59A＋3.17B＋4.33C＋2.32D-1.92AB＋1.70AC-2.85AD-2.38BC-1.40BD-1.08CD-7.83A2-3.67B2-3.74C2-4.85D2

由表6可以看出，本实验所选用的二次多项模型具有高度的显著性（p＜0.0001），其R2为0.9620，这表明黑小麦中碱溶性硒蛋白的提取率有96.20%来源于所选变量，即NaOH溶液浓度、酸化pH、（NH4）2SO4饱和度、料液比。因此，此模型拟合情况较好，可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。回归方程的各项方差分析结果表明，一次项和二次项都有显著性因素，因此各实验因素对碱溶性硒蛋白的提取率的影响不是简单的线性关系。所以，可以利用该回归方程确定最佳工艺条件。根据回归模型做出相应的响应曲面图见图6（A、B）。

图6（A）为NaOH浓度与料液比对碱溶性硒蛋白提取率的影响。随着NaOH浓度的升高，碱溶性硒蛋白的提取率先增大后减小；随着料液比的增大，该提取率逐渐增大，而当料液比继续增大时，提取率没有明显的增大或者减小。从响应曲面图可以看出曲面的坡度比较陡。这表明NaOH浓度与料液比二者的交互作用较显著。

表6 回归模型的方差和显著性分析结果Table 6 Coefficient and significance of regression model

图6 响应面分析法优化提取硒蛋白曲面图Fig.6 The response surface on extraction alkali-soluble selenoprotein

图6（B）为酸化pH与硫酸铵饱和度对碱溶性硒蛋白提取率的影响。碱溶性硒蛋白的提取率随着酸化pH的逐渐升高，呈上升趋势；随着硫酸铵饱和度的增大，该提取率也呈上升趋势。从图6B可以看出曲面的坡度比较陡。这说明酸化pH与硫酸铵饱和度二者的交互作用是较明显的。

通过软件分析，得到黑小麦中碱溶性硒蛋白的提取的最佳工艺条件为NaOH溶液浓度：0.17 mol/L、酸化pH4.72、硫酸铵饱和度：66.30%、料液比1∶10.07，该条件下黑小麦中碱溶性硒蛋白的提取率预测值为76.5593%。为检验响应曲面法所得的结果的可靠性，采取上述最优提取条件进行实验，同时考虑到实际操作的情况，将碱溶性硒蛋白的提取条件修正为NaOH溶液浓度0.17 mol/L、酸化pH4.7、硫酸铵饱和度66.0%、料液比1∶10，此时提取率76.7%。该值与理论最大值接近，说明采用响应曲面法优化黑小麦中碱溶性硒蛋白的提取工艺可行。

3 结论

硒的分布结果表明，在黑小麦中硒蛋白的含量最高为（240.52±0.3）mg/g；在黑小麦的各类硒蛋白中，碱溶性硒蛋白的含量最高为（146.21±0.3）mg/g。在本课题中还对硒蛋白中的各种氨基酸含量进行了测定，结果表明，在硒蛋白中所含氨基酸的种类很丰富，硒蛋白中胱氨酸的含量却为0，可能是因为硒取代了胱氨酸中的硫而生成硒代胱氨酸或者硒代半胱氨酸，这需要进一步的探讨与研究。

通过响应面实验对蛋白质的提取率进行了优化，得出新春36号黑小麦中碱溶性硒蛋白的提取最优条件是：NaOH溶液浓度为0.17 mol/L、酸化pH为4.7、硫酸铵饱和度为66.0%、料液比为1∶10，此条件下碱溶性硒蛋白的提取率为76.7%。

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Study on the distribution and the extraction process of rich proteins of Xinchun No.36 Triticale in Xinjiang province

LI Tian，ZHU Xin-rong*，ZHANG Jian*，TIAN Tong-tong
（Food College of Shihezi University，Shihezi 832000，China）

The purpose of this work was to study the distribution of Se in Xinchun No.36 triticale in Xingjiang province.Through single factor experiment and response surface method，a systematic inspection of selenoproteins，selenium polysaccharide，selenium nucleic acid and selenoproteins of solubility in different solvents was made.The results showed that content of selenoproteins，selenium ploysaccharide and nucleic acid selenium was（240.52±0.3），（32.45±0.21）and（4.65±0.05）mg/g respectively.The content of selenoproteins of alkali-soluble，water-soluble，salt-soluble and alcohol-soluble was（146.21±0.3），（41.52±0.6），（19.40±0.06）and（13.65±0.12）mg/g respectively.Furthermore，in order to get more alkali-soluble selenoproteins，the optimal extraction technology was obtained by the single factor test and the response surface design experiments.The optimal extraction conditions were NaOH 0.17 mol/L，acidification at pH4.7，saturation of（NH4）2SO466.0%，the ratio of solid to liquid 1∶10，the predicted rate of protein extraction was 76.5593%，but the actual value of experiment reached 76.7%.

selenoproteins；distribution；rate of extraction

TS210.1

B

1002-0306（2015）22-0267-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.047

2015－03－04

李甜（1991-），女，硕士研究生，研究方向：食品工程，E-mail：464828569@qq.com。

*通讯作者：朱新荣（1977-），女，讲师，研究方向：食品科学，E-mail：1678481898@qq.com。

张建（1979-），男，副教授，研究方向：食品生物化学，E-mail：zhangjian0411@163.com。

石河子大学应用基础研究青年项目（2014ZRKXYQ14）；石河子大学青年骨干教师培训（3152SPXY01027）。