刘 畅，江连洲，李小雅，孙树坤，韩翠萍，*，江杨娟，赵 月，王 迪

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030；2.国家大豆工程技术研究中心，黑龙江哈尔滨150030）

响应面法优化黑豆纳豆的制取工艺研究

刘 畅1，江连洲1，李小雅1，孙树坤2，韩翠萍1，*，江杨娟1，赵 月1，王 迪1

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨150030；2.国家大豆工程技术研究中心，黑龙江哈尔滨150030）

针对纳豆口味的不适宜性，以黑豆为原料，采用响应面分析法，以感官评价为响应值，研究黑豆纳豆的发酵工艺。结果表明，得到的黑豆纳豆发酵的最佳条件为：浸泡时间为19.5 h，发酵时间为23.5 h，接种量为4.5%。以此条件制作出的纳豆呈灰黑色，有纳豆香味，口感酥软，得到黑豆纳豆感官评分的平均值为8.57。因此选用黑豆作为原材料发酵成纳豆，在未来市场中具有广阔的发展前景。

黑豆纳豆，发酵，制取工艺，响应面法分析

纳豆是日本的传统发酵食品，迄今已有2000多年的历史[1]，与中国的豆豉有很深的渊源[2]。纳豆是将大豆煮熟后，经纳豆菌繁殖发酵后而形成的发酵食品[3]。纳豆的制作工艺分传统法和工业法两种，传统法依地区和配方不同而各有差异，工业法全国比较统一[4]。纳豆中所含的纳豆激酶（枯草杆菌蛋白酶）[5]、超氧化物歧化酶、异黄酮等多种生理活性物质具有很好的溶血栓、抗氧化等保健功能[6]，与传统的溶栓剂相比，纳豆激酶具有不易引起出血、无抗原性、半衰期长、安全无毒且成本低廉和能口服吸收、溶栓等优点，因而具有广阔的开发前景，可能成为新一代的溶栓药物[7]。

黑豆又名乌皮青仁豆或乌皮黄仁豆，为豆科植物大豆的黑色种子[8]，原产中国安徽[9]，其加工制作的产品畅销欧美、日韩和东南亚等地区，且供不应求[10]。黑豆中不仅含有丰富的蛋白质、脂肪、维生素、胡萝卜素、微量元素和粗纤维等多种营养物质[11]，具有预防动脉血管硬化、骨质疏松、大脑老化等功能，其黑色种皮中还含有对人体有益的异黄酮类——大豆黄酮苷和花色苷等成分[12]。大豆黄酮苷里含有A、B、C、D、E 5个苷元，具有对人体有益的生理生化作用[13]。黑豆中的多糖成分还可以促进骨髓组织的生长，刺激造血功能的再生[14]。

黑豆是一种食药兼备的物质，但是黑豆主要用于生产草药和饲料，市面上在食品中的应用并不多[15]。本文在传统纳豆生产的基础上做了一些技术调整，以具有降血脂、防衰老等诸多功能的黑豆为原料，采用响应面分析法，以感官评价为响应值，分别对黑豆的浸泡时间、纳豆菌接种量、发酵温度、发酵时间、后熟时间进行了探究。在此条件下制作的纳豆营养价值将会更加丰富，更能较好地掩盖传统纳豆的氨味，更加符合中国国情，适合中国居民。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜黑豆 山东省临沂市老郭农家店；纳豆芽孢杆菌 广州市微元生物科技有限公司，有效活菌数≥200亿/g；脱脂棉纱布 新乡市大方医疗器械制造有限公司。

HZQ-F160全温振荡培养箱 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；SZ26H2不锈钢锅 浙江苏泊尔股份有限公司；WK2102T电磁炉 佛山市顺德区澳特莱斯电器有限公司；BS-180.4分析天平 上海卓精电子科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 加工工艺流程 选黑豆→清洗→浸泡→蒸煮→冷却→接种→发酵→后熟→调味[16]。

1.2.2 加工工艺要点 在水温25～28℃、水量3倍条件下浸泡，至黑豆发胀无褶皱。将浸泡好的黑豆放入不锈钢锅中蒸煮2 h左右，蒸煮后豆粒用手可直接捏软即可。将蒸制好的黑豆冷却至室温，在清洗干净的烧杯中用蒸出的豆汁溶解一定量的纳豆菌，搅拌后，将豆汁倒入小喷壶内，均匀喷洒在冷却的黑豆上，进行接种。接种后将黑豆均匀摊开在烧杯中，厚度不要超过4 cm，容器上面铺上干净白纱布，以维持湿度。接种后在一定温度恒温培养箱中培养一定时间，直至表面出现白膜且有拉丝为佳。将发酵好的纳豆放入4℃冰箱中进行后熟处理[17-18]。

1.2.3 单因素实验

1.2.3.1 浸泡时间对黑豆纳豆制取工艺的影响 取30 g黑豆进行实验，每组10 g，将黑豆分别浸泡12、16、20、24、28 h，蒸煮、冷却后进行接种，接种量4%，接种后在33℃恒温培养箱中发酵22 h，最后放入4℃冰箱后熟，时间为24 h，对产品进行感官评定，结果取平均值。

1.2.3.2 纳豆菌接种量对纳豆制取工艺的影响 取30 g黑豆进行实验，每组10 g，将黑豆浸泡20 h，蒸煮、冷却后进行接种，接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%，接种后在33℃恒温培养箱中发酵22 h，最后放入4℃冰箱后熟，时间为24 h，对产品进行感官评定，结果取平均值。

1.2.3.3 发酵温度对纳豆制取工艺的影响 取30 g黑豆进行实验，每组10 g，将黑豆浸泡20 h，蒸煮、冷却后进行接种，接种量4%，接种后分别在27、30、33、36、39℃的恒温培养箱中发酵22 h，最后放入4℃冰箱后熟，时间为24 h，对产品进行感官评定，结果取平均值。

1.2.3.4 发酵时间对纳豆制取工艺的影响 取30 g黑豆进行实验，每组10 g，将黑豆浸泡20 h，蒸煮、冷却后进行接种，接种量4%，接种后在33℃恒温培养箱中分别发酵14、18、22、26、30 h，最后放入4℃冰箱后熟，时间为24 h，对产品进行感官评定，结果取平均值。

1.2.3.5 后熟时间对纳豆制取工艺的影响 取30 g黑豆进行实验，每组10 g，将黑豆浸泡20 h，蒸煮、冷却后进行接种，接种量4%，接种后在33℃恒温培养箱中发酵22 h，最后放入4℃冰箱中进行后熟，后熟时间分别为16、20、24、28、32 h，对产品进行感官评定，结果取平均值。

在进行电路设计时为了减少电源对信号的影响，在SIM-RST和SIM-CLK引脚两端加入了100 pf的滤波电容以增强稳定性。同时为了节约空间，SIM卡槽设计在PCB板背面，既美观大方，又减少布线的长度。

1.2.4 响应面法优化黑豆纳豆制取工艺实验 在考察了浸泡时间、纳豆菌接种量、发酵温度、发酵时间、后熟时间等单因素基础上，通过Box-Behnken实验设计法，选定浸泡时间、发酵时间、接种量3个因素作为目标变量，实验因素及水平见表1。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 Experimental design of RSM

1.2.5 感官评价 在实验室中对制取的新鲜纳豆进行感官评价，由10名20～30岁的感官评价人员组成评价小组，其中男性成员5名，女性成员5名[19]。根据感官评价的标准和要求对评价小组进行适当的培训。满分为10分，感官评分标准见表2[20-21]。

1.2.6 数据处理 通过Origin7.5和Design-Expert 8.0、SPSS Statistics20.0对所得数据进行分析。

表2 感官评价表Table 2 The evaluation of sensory qualities

2 结果与讨论

2.1 单因素实验

2.1.1 浸泡时间对纳豆制取工艺的影响 由图1可以看出，浸泡时间20 h与浸泡时间16、28 h差异显著（p＜0.05），浸泡时间20 h与浸泡时间12 h差异显著（p＜0.05），浸泡时间过短黑豆不能充分吸收水分，时间过长，细菌过度繁殖，纳豆口味变差，浸泡时间在20～24 h时，感官评分趋于平稳，在20 h时达到最高值。

2.1.2 纳豆菌接种量对纳豆制取工艺的影响 实验结果见图2，纳豆菌的接种量对纳豆制取工艺的影响颇为显著。在接种量为1%～3%之间，纳豆感官评分呈显著（p＜0.05）上升趋势。在3%～5%之间，感官评分趋于平稳，在4%时达到最大值。这是因为低浓度时，纳豆芽孢杆菌不能充分、完全的催化纳豆进行发酵。浓度较高时，在一定量基质（纳豆）的前提下，只有部分纳豆芽孢杆菌能较完全的吸收利用黑豆中的营养物质，因而感官评分不会产生较大的变化。

图1 浸泡时间对纳豆制取工艺的影响Fig.1 Effect of soaking time on the preparation technology of natto

图2 纳豆菌接种量对纳豆制取工艺的影响Fig.2 Effect of Bacillus natto inoculation on the preparation technology of natto

2.1.3 发酵温度对纳豆制取工艺的影响 由图3可以看出，随发酵温度的升高，纳豆感官评分呈现较明显的先增大后减小的变化趋势，在温度33℃时达到最高。

图3 发酵温度对纳豆制取工艺的影响Fig.3 Effect of fermentation temperature on the preparation technology of natto

2.1.4 发酵时间对纳豆制取工艺的影响 由图4可知，纳豆感官评分随发酵时间的增加呈现先升高后下降的趋势，这是由于随着发酵时间的延长，纳豆菌与纳豆表面的接触时间也随之延长，因纳豆芽孢杆菌是嗜氧菌，所以接触空气的时间越长，其吸收利用黑豆蛋白中的营养物质来繁殖丝氨酸蛋白酶（即纳豆激酶）的时间就越长，发酵效果就越好。发酵前期，由于时间较短，纳豆芽孢杆菌中的活性物质没有完全释放。而发酵后期，随着时间延长，纳豆芽孢杆菌中的另一些好氧细菌开始迅速繁殖，对其有效的活性成分的发挥造成了不良影响，所以评分呈下降趋势[22]。

图4 发酵时间对纳豆制取工艺的影响Fig.4 Effect of fermentation time on the preparation technology of natto

2.1.5 后熟时间对纳豆制取工艺的影响 从图5可以看出，后熟时间对纳豆感官评分的影响并不明显，呈现先上升后下降的趋势，后熟时间24 h时感官评分达到最大值。

图5 后熟时间对纳豆制取工艺的影响Fig.5 Effect of after-ripening time on the preparation technology of natto

2.2 响应面法优化黑豆纳豆制取工艺

2.2.1 分析因素选择及分析方法 根据Box-Behnken实验设计原理，采用三因素三水平响应面法确定黑豆纳豆制取工艺，实验设计及结果见表3。

2.2.2 模型建立及显著性分析 利用Design-Expert 8.0软件对表3中的数据进行多元回归拟合分析，以感官评价得分为响应值（Y），各因素对响应值的响应模型为：

Y=8.18+0.39A+0.21B+0.50C-0.025AB-0.30AC+ 0.20BC-1.38A2-0.78B2-0.10C2

表3 响应面分析实验设计及结果Table 3 Design and results of RSM

对该模型进行方差分析，结果见表4。由表4可知，响应面回归模型极显著（p＜0.0001）；模型失拟项不显著（p=0.3939＞0.05），说明方程和实验拟合较好。该方程的相关系数R2=0.9814，说明该模型能解释98.1%的响应值变化，即该模型与实际实验拟合程度良好，实验误差小。本实验的CV（变异系数）为2.86%，说明其置信度较高，模型方程能较好地反应真实的实验值。由表4还可知，在总因素中，一次项A、C以及二次项A2、B2项对纳豆感官评分影响极显著（p＜0.01），一次项B以及二次项AC对感官评分影响显著（p＜0.05）。由F值可知，各单因素对纳豆感官评分的影响次序为纳豆菌接种量＞浸泡时间＞发酵时间；各两因素间交互作用影响次序为发酵时间和接种量＞浸泡时间和接种量＞浸泡时间和发酵时间。

表4 响应面方差分析Table 4 Analysis of variance of RSM

图6 浸泡时间和发酵时间交互作用对纳豆感官评分影响的响应面图Fig.6 Response surface plot of Effect of soaking time and fermentation time as well as their mutual interactions on natto sensory score

图7 浸泡时间和接种量交互作用对纳豆感官评分影响的响应面图Fig.7 Response surface plot of Effect of soaking time and Bacillus natto inoculation as well as their mutual interactions on natto sensory score

2.2.3 响应面分析与优化 根据回归方程，可作出响应面图，直观反映了浸泡时间、发酵时间、接种量及其交互对响应值的影响。由图6～图8可以看出，浸泡时间与接种量的交互作用对纳豆感官评分的影响显著，响应面表现为曲线较陡。浸泡时间过短或过长，原材料没有经过恰当的预处理，使黑豆不能与纳豆芽孢杆菌充分反应；随着接种量的增加，微生物生长繁殖加快，运动加快，代谢增强，充分吸收、利用了黑豆中的多种营养物质，使黑豆能够更好的进行发酵，从而纳豆感官评分逐渐升高。浸泡时间与接种量、浸泡时间与发酵时间的交互作用不显著。通过软件分析，黑豆纳豆的感官评分最优参数为浸泡时间19.46 h，发酵时间23.43 h，接种量为4.55%，在此条件下黑豆纳豆感官评分最高为8.59。

图8 发酵时间和接种量交互作用对纳豆感官评分影响的响应面图Fig.8 Response surface plot of Effect of fermentation time and Bacillus natto inoculation as well as their mutual interactions on natto sensory score

2.2.4 回归模型的验证实验 为检验所得结果的可靠性，采用上述优化条件进行验证实验，考虑操作的方便性，制取条件修正为：浸泡时间为19.5 h，发酵时间为23.5 h，接种量为4.5%，重复三次，得到黑豆纳豆感官评分的平均值为8.57，与预测值接近，由此可见利用响应值分析法确立黑豆纳豆的最佳制取工艺是可行的。

3 结论

本研究应用响应面分析方法，参照传统纳豆生产工艺，开发并优化了黑豆纳豆的制取工艺。在单因素实验的基础上，得出黑豆纳豆的最佳制取工艺为：浸泡时间为19.5 h，发酵时间为23.5 h，接种量为4.5%，在此条件下制作出的纳豆呈灰黑色，有纳豆香味，口感酥软，黑豆纳豆的感官评分为8.57，与响应面法设计的实验预测值8.59差异不显著，验证了实验模型的可行性，故所得黑豆纳豆制取工艺条件切实可行，具有实际应用价值。

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Optimization of preparation technology of natto from black soybean by response surface methodology

LIU Chang1，JIANG Lian-zhou1，LI Xiao-ya1，SUN Shu-kun2，HAN Cui-ping1，*，JIANG Yang-juan1，ZHAO Yue1，WANG Di1
（1.College of Food Science，Northeast Agriculture University，Harbin 150030，China；2.National Soybean Engineering Technology Research Center，Harbin 150030，China）

For getting the suitability of natto flavor，black soybean was took as raw material，using response surface analysis method，the sensory evaluation was used as response value.Studying the fermentation technology of black soybean natto.The results showed the optimal fermentation conditions were as follows：soaking time 19.5 h，the fermentation time 23.5 h，inoculation 4.5%.Under the optimal conditions，natto was gray black，with natto smelled，soft.Therefore took black soybeans as raw material to make natto by fermentation had a broad development prospect in the future market.

black soybean natto；fermentation；processing technology；response surface methodology

TS214.2

B

1002-0306（2015）22-0262-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.046

2015－03－19

刘畅（1990-），女，硕士研究生，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：15945166865@163.com。

*通讯作者：韩翠萍（1974-），女，博士，教授，研究方向：粮食、油脂及植物蛋白工程，E-mail：cphan2006@126.com。

国家科技支撑计划项目（2014BAD22B01）。