陆光兴，罗 宸，+，毛江川，杨 晗，贾 云，蒋巧诗，张洪涛，詹晓北，，*，朱 莉

（1.江南大学生物工程学院，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；2.江苏瑞光生物科技有限公司，江苏无锡214125）

有机溶剂分级沉淀分离线性β-1，3-葡寡糖

陆光兴1，罗 宸1，+，毛江川1，杨 晗1，贾 云1，蒋巧诗1，张洪涛1，詹晓北1，2，*，朱 莉2

（1.江南大学生物工程学院，糖化学与生物技术教育部重点实验室，江苏无锡214122；2.江苏瑞光生物科技有限公司，江苏无锡214125）

盐酸水解二甲亚砜中的热凝胶可大规模地制备线性β-1，3-葡寡糖。为了快速高效地分离二甲亚砜中线性β-1，3-葡寡糖，采用不同种类的有机溶剂进行沉淀和分级沉淀。十三种常见有机溶剂中九种可以沉淀热凝胶水解产物，其中二氯甲烷和乙酸乙酯具有较高的应用可行性。二氯甲烷和乙酸乙酯可以分级沉淀分离线性β-1，3-葡寡糖，乙酸乙酯使用体积较小但选择性较差。分级沉淀效果受热凝胶浓度、水含量和离子强度的影响，而不受水解程度的影响。有机溶剂分级沉淀法可以快速高效地终止水解反应和分离水解产物，并可进一步回收二甲亚砜和有机溶剂进行重复利用，对β-1，3-葡寡糖的分离纯化具有重要的指导意义。

热凝胶，线性β-1，3-葡寡糖，二甲亚砜，有机溶剂，分级沉淀

寡糖是由3～10个单糖单元通过糖苷键连接构成的低分子碳水化合物[1]。功能性寡糖因具有良好的生物活性广泛应用于饲料、食品、医药、化妆品等领域[2-3]。线性β-1，3-葡寡糖是由葡萄糖通过β-1，3-糖苷键连接而成的功能性低聚糖，研究证明其具有抗肿瘤[4]、增强人体免疫力[5]、刺激产生细胞因子[6]和诱导植物抗病[7]等功能。

热 凝 胶（Curdlan）是一 种 由 土 壤 杆 菌（Agrobacterium sp.）合成[8]的线性β-1，3-葡聚糖，广泛应用于食品、化工、农业和医药工业中[9-10]。二甲亚砜被誉为“万能溶剂”和“万能药”[11]，可用于食品生产[12]和医药临床[13]而不必担心其毒性。研究发现盐酸水解溶解于二甲亚砜中的热凝胶可批量制备线性β-1，3-葡寡糖，并具有价格便宜、高效快速、产品纯度高等优点[14]。

目前寡糖分离纯化的主要方法为层析或膜分离，层析法[15]存在耗时久、费用高、设备复杂的问题，膜分离法[16]相对而言操作比较简便、生产过程污染小，但仍需使用特殊设备。分级沉淀是一种简便快速的分离方法，在生命科学和食品科学中主要用于多糖、蛋白或糖蛋白，沉淀寡糖的报道比较少见或效果不佳。傅赟彬等[14]利用丙酮沉淀二甲亚砜中的热凝胶水解产物得到聚合度2～19的线性β-1，3-葡寡聚糖，但是并没有对有机溶剂的种类进行筛选，也没有利用分级沉淀分离线性β-1，3-葡寡糖。

本文利用盐酸控温水解二甲亚砜中的热凝胶，探索中和法和有机溶剂沉淀法中止水解反应并分离水解产物。利用二氯甲烷和乙酸乙酯分级沉淀分离线性β-1，3-葡寡糖，并探索热凝胶浓度、水解程度、水含量、离子强度对分级沉淀效果的影响。有机溶剂分级沉淀法既能中止水解反应又能快速高效分离线性β-1，3-葡寡糖，对线性β-1，3-葡寡糖的分离纯化具有较好的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

热凝胶 日本武田-麒麟公司，食品级；高效硅胶薄层层析铝箔板（Silica gel 60 F254） 德国Merck公司；二甲亚砜、浓盐酸、浓硫酸、NaOH、Na2CO3、浓氨水、甲醇、乙醇、异丙醇、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、苯、丙酮、乙酰丙酮、乙酸乙酯、乙醚、石油醚、丙醛 国药集团化学试剂有限公司，分析纯。

AL204型分析天平 梅特勒-托利多仪器公司；852型数显恒温磁力搅拌器 金坛市大地自动化仪器厂；XW-80A型旋涡混合器 上海精科实业公司；HH60（0）电子恒温水浴锅 苏州威尔实验用品有限公司；Sigma 2K5S离心机 Sigma-Aldrich Inc；DHG-9145A型电热鼓风干燥箱 上海一恒科学仪器公司。

1.2 实验方法

1.2.1 热凝胶水解产物的制备 量取50 mL二甲亚砜于100 mL小烧杯中，置于80℃的大功率磁力搅拌器上边搅拌边缓慢加入500 mg热凝胶粉末，继续加热搅拌直至形成均一透亮的热凝胶溶液（10 g/L）。取50 mL离心管分装10 mL热凝胶溶液后加入浓盐酸至盐酸终浓度0.5 mol/L，封盖后漩涡振荡30 s后置于80℃水浴锅中水解90 min[14]。

1.2.2 中和法中止水解反应 取水解液分别加入三种常用的碱性物质（NaOH、Na2CO3、浓氨水）进行中和，漩涡振荡3 min使其充分反应继续调节pH至7.0。10000 r/min离心10 min后取上清进行一次TLC展开分析。

1.2.3 加热蒸发去除二甲亚砜 取中和水解液加入一倍体积的去离子水，漩涡振荡30 s混合均匀，分别采用金属浴加热、酒精灯加热和真空旋蒸去除二甲亚砜。金属浴加热温度为110～150℃；真空旋蒸的真空度为-0.1 MPa，温度为85℃，旋转速度为100 r/min。

1.2.4 有机溶剂沉淀热凝胶水解产物 取水解液分别加入1～5倍体积的有机溶剂（甲醇、乙醇、异丙醇、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、丙酮、乙酰丙酮、苯、乙酸乙酯、乙醚、石油醚、丙醛），高速漩涡振荡30 s并静置观察是否有沉淀析出。10000 r/min离心10 min，倒取上清并将离心沉淀用去离子水复溶到原体积，取上清和沉淀复溶液进行一次TLC展开分析。

1.2.5 二氯甲烷和乙酸乙酯分级沉淀体积的确定取水解液加入1.6～2.0或4.3～5.1倍体积的二氯甲烷，高速漩涡振荡30 s后10000 r/min离心10 min，倒取上清并将离心沉淀用去离子水复溶到原体积，取上清和沉淀复溶液进行两次TLC展开分析。另取水解液加入1.9～2.3或3.2～3.6倍体积的乙酸乙酯进行沉淀和分析。

1.2.6 二氯甲烷和乙酸乙酯分级沉淀分离线性β-1，3-葡寡糖 取水解液加入2.0倍体积的二氯甲烷或2.2倍体积的乙酸乙酯，高速漩涡振荡30 s后10000 r/min离心10 min，倒取上清再分别加入2.7倍体积二氯甲烷或1.2倍体积的乙酸乙酯，高速漩涡振荡30 s后10000 r/min离心10 min，倒取上清并将两次离心沉淀用去离子水复溶到原体积，取上清和两次沉淀复溶液进行两次TLC展开分析。

1.2.7 热凝胶浓度对分级沉淀效果的影响 制备10、20、30、40、50、60 g/L的热凝胶二甲亚砜溶液，分装10 mL并添加浓盐酸至盐酸浓度0.5 mol/L后置于80℃水浴锅水解90 min，按照1.2.6进行分级沉淀和两次TLC展开分析。

1.2.8 水解程度对分级沉淀效果的影响 制备10 g/L的热凝胶二甲亚砜溶液，分装10 mL并添加浓盐酸至盐酸浓度0.5 mol/L后置于80℃水浴锅分别水解60、80、90、100、120、140 min，按照1.2.6进行分级沉淀和两次TLC展开分析。

1.2.9 水含量对分级沉淀效果的影响 制备10 g/L的热凝胶二甲亚砜溶液，分装10 mL并添加浓硫酸至硫酸浓度0.5 mol/L后置于80℃水浴锅水解90 min，水解结束后分别添加去离子水至水含量为0、1‰、5‰、1%、5%、10%，按照1.2.6进行分级沉淀和两次TLC展开分析。

1.2.10 离子强度对分级沉淀效果的影响 制备10 g/L的热凝胶二甲亚砜溶液，分装10 mL并添加浓盐酸至盐酸浓度0.5 mol/L后置于80℃水浴锅水解90 min，水解结束后分别添加CaCl2至含量为0、1‰、5‰、1%、5%、10%，按照1.2.6进行分级沉淀和两次TLC展开分析。

1.2.11 一次TLC展开分析 取1.5 μL待测样品点到Silica gel 60 F254薄层层析板上（展距10 cm，宽度裁剪到合适长度），展开剂为乙酸-乙酸乙酯-水（V/V/ V=2∶2∶1）。展开完毕后75℃烘干5 min，喷硫酸-乙醇-地衣酚显色剂（0.2%w/V地衣酚，11%V/V硫酸-乙醇溶液），105℃烘箱烘干5 min显色[17]。

1.2.12 两次TLC展开分析 实验方法同1.2.11，展距20 cm，两次展开的展开剂为乙酸-乙酸乙酯-水（V/ V/V=2∶2.4∶1.4），一次展开后将TLC板置于鼓风干燥箱75℃烘干5 min，再次置于展开缸中展开分析。

2 结果与分析

2.1 中和法中止反应

图1 中和反应后上清TLC分析Fig.1 TLC analysis of the supernatant after neutralization reaction

NaOH、Na2CO3和浓氨水都可用于中和HCl，实验发现NaOH和浓氨水的中和速度较快而Na2CO3中和速度较慢。室温下NaCl在二甲亚砜中的溶解度只有5 g/L[18]，因此NaOH和Na2CO3中和时生成的NaCl大量沉淀析出，NH4Cl具有一定的溶解度导致浓氨水中和时并未出现沉淀。TLC分析显示1、2、3的颜色逐渐加深，说明1、2、3的糖含量逐渐升高，因此NaOH和Na2CO3中和生成的沉淀会吸附糖。氨水中和后的混合液则因含盐高导致显色斑呈现月牙状。NaOH既能很快终止反应又能快速除去生成的NaCl，可以用于水解产物分离后二甲亚砜的中和脱盐。

2.2 加热蒸发去除二甲亚砜

二甲亚砜常压沸点高达189℃，含水后沸点下降，因此加入去离子水将有助于二甲亚砜的加热去除。实验发现金属浴加热在110℃以上时含水溶液发生轻微沸腾，随着加热时间的延长蒸发越来越慢，30 min时仍有超过原蒸发体积一半的溶液存在。酒精灯加热时含水溶液很快发生剧烈沸腾，随着加热时间的延长水解液逐渐变为黄色，考虑到DMSO在高温下稳定性下降，酒精灯加热不适合二甲亚砜的去除。旋转蒸发的去除速度和金属浴相似，旋蒸30 min后还有超过一半体积的溶液存在。因此加热蒸发不能有效去除二甲亚砜且耗能很大，难以运用到工业化生产中。据报道二甲亚砜做溶剂生产蔗糖酯时工艺简单、条件温和、产率高，但最终产品却难以纯化[19]。因此必须探索其他方法分离热凝胶水解产物与二甲亚砜。

表1 有机溶剂加入10 g/L热凝胶水解液的现象Table 1 Phenomena after organic solvents added into 10 g/L Curdlan hydrolysis solution

图2 有机溶剂沉淀10 g/L热凝胶水解产物Fig.2 Organic solvents precipitate 10 g/L Curdlan hydrolysis product

2.3 有机溶剂沉淀热凝胶水解产物

沉淀热凝胶水解产物的有机溶剂需要满足以下几个条件：对水解产物的溶解度极低甚至不溶；与二甲亚砜可以互溶；沸点尽量低，方便与二甲亚砜的分离和回收；价格便宜来源广，便于进行大规模生产；使用安全且不易污染环境。根据以上条件并参照二甲亚砜的溶解度表，筛选以下十三种有机溶剂进行实验：甲醇、乙醇、异丙醇、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、丙酮、乙酰丙酮、苯、乙酸乙酯、乙醚、石油醚、丙醛，结果见表1和图2。

二甲亚砜作为非质子极性溶剂能够接受热凝胶分子羟基提供的质子[20]，破坏热凝胶的分子内氢键，将原来缠绕紧密的的棒状结构变为无规则卷曲状态。可能因为二甲亚砜抢占了热凝胶分子内氢键形成的基团位置，形成了一种类似于水化层的二甲亚砜层。当在热凝胶二甲亚砜水解液中加入有机溶剂后溶液的介电常数下降，导致糖分子间的静电引力增大而相互凝结析出[21]。

二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯等九种有机溶剂可以不同程度地沉淀热凝胶水解产物。甲醇、乙醇和异丙醇只能沉淀较大分子量的糖，寡糖主要保留在上清液中；二氯甲烷、氯仿、丙酮、苯、乙酰丙酮和乙酸乙酯可以沉淀寡糖，效率由高到低依次为氯仿、苯、乙酸乙酯、二氯甲烷、丙酮和乙酰丙酮。从毒性上分析，苯的毒性最高，氯仿毒性较高，丙酮、二氯甲烷和乙酰丙酮的毒性较低，乙酸乙酯无毒。考虑到沉淀效果、使用安全性、回收难易等因素，二氯甲烷和乙酸乙酯具有较高的应用可行性。

2.4 二氯甲烷和乙酸乙酯分级沉淀体积的确定

图3 二氯甲烷和乙酸乙酯分级分离线性β-1，3-葡寡糖Fig.3 Linear β-1，3-glucooligosaccharides separation by fractional precipitation of methylene chloride and ethyl acetate

根据水解产物溶解度的不同，可以利用有机溶剂分级沉淀分离不同聚合度的水解产物。随着有机溶剂加入体积的增大，离心上清中的寡糖种类越来越少，沉淀中的寡糖种类越来越多。为了更好的显示分级沉淀的效果，可在优化展开剂的基础上进行两次展开分析[22]。对于10 g/L的热凝胶水解液，二氯甲烷沉淀时，2.0倍体积的二氯甲烷沉淀的上清中主要是小分子糖和寡糖如图3（A），4.7倍体积沉淀时沉淀中主要为寡糖和大分子糖如图3（B）。乙酸乙酯沉淀时，2.2倍体积的二氯甲烷沉淀的上清中主要是小分子糖和寡糖如图3（C），4.7倍体积沉淀时沉淀中主要为寡糖和大分子糖如图3（D）；

由图3（A）、（C）分析可知2.0倍体积的二氯甲烷或2.2倍体积乙酸乙酯可以较好地沉淀聚合度大于10的大分子糖，由图3（B）、（D）分析可知4.7倍体积的二氯甲烷或3.4倍体积乙酸乙酯可以较好地沉淀聚合度大于10的大分子糖和寡糖。

2.5 二氯甲烷和乙酸乙酯分级分离线性β-1，3-葡寡糖

图4 二氯甲烷和乙酸乙酯分级沉淀分离线性β-1，3-葡寡糖Fig.4 Separation of linear β-1，3-glucooligosaccharides by fractional precipitation of methylene chloride or ethyl acetate

5倍体积氯仿可以较完全的沉淀热凝胶水剂产物，可以用5倍体积氯仿沉淀热凝胶水解产物的复溶液作为TLC分析的参照。由图4分析可知对于10 g/L的热凝胶水解液，2.0倍体积的二氯甲烷或2.2倍体积的乙酸乙酯可以充分沉淀大分子糖，补加2.7倍体积的二氯甲烷或1.2倍体积的乙酸乙酯后寡糖也得到了充分沉淀，进一步验证了2.4探索的分级沉淀线性β-1，3-葡寡糖的体积。分级沉淀有两个重要指标：一是有机溶剂的用量，二是沉淀的选择性。两种沉淀剂相比而言二氯甲烷使用体积较大，沉淀的选择性更好；而乙酸乙酯的使用体积较小，沉淀的选择性较差。二氯甲烷和乙酸乙酯分级沉淀各有优缺点，可以根据不同的需要选择使用。

2.6 热凝胶浓度对分级沉淀效果的影响

随着热凝胶浓度的升高，二氯甲烷和乙酸乙酯第一次沉淀中糖组成由原来的大分子糖逐渐变为大分子糖、寡糖和小分子糖，因此沉淀大分子糖所需的溶剂体积应越来越少；第二次沉淀复溶液中糖组成由原来的寡糖逐渐变为寡糖和小分子糖，因此沉淀寡糖所需的溶剂体积应越来越少。此外，热凝胶浓度的升高会降低两种有机溶剂分级沉淀的选择性。更高热凝胶浓度会增加水解产物相互碰撞的机会，有助于水解产物的凝集析出。

2.7 水解程度对分级沉淀效果的影响

随着水解程度的升高，二氯甲烷和乙酸乙酯第一次沉淀、第二次沉淀和第二次沉淀上清中的寡糖组分并未发生明显变化，因此水解程度的高低对二氯甲烷和乙酸乙酯分级沉淀没有明显影响。分级沉淀的原理是水解产物在混合体系中溶解度不同，同种聚合度水解产物的溶解度是不变的，因此水解程度对沉淀没有影响。

图5 热凝胶浓度对分级沉淀效果的影响Fig.5 Influences on fractional precipitation of Curdlan concentration

图6 水解程度对分级沉淀效果的影响Fig.6 Influences on fractional precipitation of degree of hydrolysis

2.8 水含量对分级沉淀效果的影响

图7 水含量对分级沉淀效果的影响Fig.7 Influences on fractional precipitation of water content

随着水含量的升高，二氯甲烷第一次沉淀的糖组分由大分子糖逐渐变为大分子糖和寡糖，而第二次沉淀的糖组分始终没有明显变化；乙酸乙酯第一次沉淀的糖组分始终没有明显变化，而第二次沉淀的糖组分由寡糖逐渐变为寡糖和小分子糖。因此随着水含量的升高，二氯甲烷沉淀大分子糖所需体积越来越少，沉淀寡糖所需的体积没有明显变化；乙酸乙酯沉淀大分子糖所需体积没有明显变化，沉淀寡糖所需体积越来越少。由图7可知，与热凝胶浓度一样，水含量的升高也会降低两种有机溶剂分级沉淀的选择性。

2.9 离子强度对分级沉淀效果的影响

图8 离子强度对分级沉淀效果的影响Fig.8 Influences on fractional precipitation of ionic intensity

随着离子强度的升高，二氯甲烷第一次沉淀中糖组成由原来的大分子糖逐渐变为大分子糖、寡糖，第二次沉淀复溶液中糖组成由原来的寡糖逐渐变为寡糖和小分子糖；乙酸乙酯第一次沉淀中糖组成由原来的大分子糖逐渐变为大分子糖、寡糖和小分子糖；第二次沉淀复溶液中糖组成由原来的寡糖逐渐变为小分子糖。因此二氯甲烷、乙酸乙酯沉淀大分子糖和寡糖所需体积都越来越少。水解结束时水解液中含有盐酸可以不必中和而直接利用有机溶剂沉淀，一是较高的离子强度减少了有机溶剂的使用体积，二是能够避免盐分对水解产物的吸附。由图8可知，与热凝胶浓度和水含量一样，离子强度的升高也会降低两种有机溶剂分级沉淀的选择性。

3 结论

甲醇、乙醇、异丙醇、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、乙酰丙酮、苯、乙酸乙酯等九种常见的有机溶剂可以沉淀分离二甲亚砜中的热凝胶水解产物，其中二氯甲烷和乙酸乙酯有较高的应用可行性。二氯甲烷和乙酸乙酯沉淀10 g/L热凝胶水解液中大分子糖的用量分别为2.0倍体积和2.2倍体积，沉淀生寡糖的用量分别为4.7倍体积和3.4倍体积，且二氯甲烷的沉淀选择性高于乙酸乙酯。二氯甲烷和乙酸乙酯分级沉淀效果受热凝胶浓度、水含量和离子强度的影响，而不受水解程度的影响。尽管提高水解液中的含水量和离子强度可以减少有机溶剂的用量，但较高热凝胶浓度下提高水解液的含水量和离子强度没有必要，一是降低了沉淀的选择性，二是增加了后处理的难度和费用。分级沉淀后水解催化剂HCl可添加NaOH进行中和，并能方便地过滤或离心除去NaCl沉淀。由于常压下二甲亚砜与二氯甲烷和乙酸乙酯的沸点相差很大，因此可采用简单蒸馏分离回收二氯甲烷、乙酸乙酯和二甲亚砜。

综上所述，有机溶剂分级沉淀法不仅可以快速中止热凝胶水解反应，而且克服了中和法难以分离二甲亚砜与水解产物的难题。与层析分离和膜分离方法相比，有机溶剂分级沉淀分离生物活性β-1，3-葡寡糖快速高效、操作简便、可行性较高，对线性β-1，3-葡寡糖的分离纯化具有重要的指导意义。

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Separation of linear β-1，3-glucooligosaccharides by fractional precipitation of organic solvents

LU Guang-xing1，LUO Chen1，+，MAO Jiang-chuan1，YANG Han1，JIA Yun1，JIANG Qiao-shi1，ZHANG Hong-tao1，ZHAN Xiao-bei1，2，*，ZHU Li2
（1.Key Laboratory of Carbohydrate Chemistry and Biotechnology，Ministry of Education，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；2.Jiangsu Rayguang Biotech Co.，Ltd.，Wuxi 214125，China）

HClhydrolysis ofCurdlan in dimethylsulfoxide could massively prepare linearβ-1，3-glucooligosaccharides.Different kinds of organic solvents were selected to quickly and efficiently separate linear β-1，3-glucooligosaccharides from dimethyl sulfoxide by precipitation and fractional precipitation.Nine kinds of common organic solvents could precipitate Curdlan hydrolysis product，and high feasibility could be got by methylene chloride and ethyl acetate.Methylene chloride and ethyl acetate could be used to separate linear β-1，3-glucooligosaccharides by fractional precipitation and smaller volume but poor selectivity with ethyl acetate.Curdlan concentration，water content and ionic intensity had different influences on fractional precipitation，but degree of hydrolysis had no influence on fractional precipitation.Organic solvent fractional precipitation method could terminate Curdlan hydrolysis reaction and separate hydrolysis product efficiently and quickly.Moreover，it was conducive to recycle dimethyl sulfoxide and organic solvent.Therefore，this method had important guiding significance for separation and purification of β-1，3-glucooligosaccharides.

curdlan；linear β-1，3-glucooligosaccharide；dimethyl sulfoxide；organic solvent；fractional precipitation

TS245.9

B

1002-0306（2015）22-0256-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.045

2015-03-16 +为并列第一作者

陆光兴（1990-），男，硕士研究生，研究方向：生物化工和功能性低聚糖，E-mail：misitelu@163.com。

罗宸（1993-），女，大学本科，研究方向：功能性低聚糖，E-mail：651928872@qq.com。

*通讯作者：詹晓北（1962-），男，博士，教授，研究方向：生物化工和功能性低聚糖，E-mail：xbzhan@yahoo.com。

国家级大学生创新创业训练计划；国家自然科学基金（31171640，31201384，31271888）；无锡市科技支撑计划（CLE01N1208）；无锡市

生物农业领军型创业人才计划（“130”计划）；无锡中小企业创新基金（CBE01G1344）。