曹玉林，吴林昊，丁郭影，胡琪琳，薛秀恒，*，王志耕

（1.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽农产品加工工程实验室，安徽合肥230036；2.安徽中青检验检测有限公司，安徽合肥230088）

响应曲面法优化牛奶中雌二醇的微波提取工艺

曹玉林1，2，吴林昊1，丁郭影1，胡琪琳1，薛秀恒1，*，王志耕1

（1.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽农产品加工工程实验室，安徽合肥230036；2.安徽中青检验检测有限公司，安徽合肥230088）

为优化牛奶中雌二醇的微波提取工艺，在单因素实验的基础上，利用响应曲面法考察液料比、微波功率和微波时间对雌二醇提取率的影响，优化提取工艺。结果表明：牛奶中雌二醇微波提取的优化工艺条件为：液料比4.1∶1，微波功率475 W，微波时间61 s。在此条件下，雌二醇的最高提取率为92.77%。与超声提取方法相比，微波提取工艺具有提取时间短，得率高，能耗低，环保等优点。

牛奶，雌二醇，微波提取，响应曲面法

在人类众多的食品中，牛奶占有特殊的地位，其富含蛋白质、脂肪、维生素等多种营养成分，具有很高的营养价值，倍受人们青睐[1-2]。但是在奶牛饲养过程中，来源于饲料或牛体自身分泌的雌激素可能富集于牛奶中，导致牛奶中雌激素超标[3]。雌激素是一类可直接影响动物的代谢与繁殖，具有相似化学结构的类固醇激素。该类物质进入机体后，可干扰体内正常分泌物的合成、释放、运转、代谢及结合，激活或抑制内分泌系统功能，最终造成机体代谢调控紊乱[4-6]。雌激素主要有三种类型：雌酮、雌二醇和雌三醇，其中雌二醇的活性最强[7]。

微波萃取技术是将被萃取的原料浸于某选定的溶剂中，通过微波反应器发射微波能，使原料中的化学成分迅速溶出的技术和方法。微波萃取技术具有操作简便、经济、省时等优点，同时可以提高目标物质的回收率和纯度[8-10]。

随着雌激素残留问题日益受到重视，各种针对牛奶中雌激素的提取技术迅速发展。目前，提取牛奶中雌激素的方法有常规溶剂法[11]和超声波法[12]，耗时长、成本高，且尚未见微波法提取牛奶中雌激素的研究报道。为此，本文研究了微波技术提取牛奶中雌二醇，此方法不仅得率高而且提取时间短，能耗低，可以为今后牛奶中雌激素的研究提供前处理依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

雌二醇标准品 Sigma公司；乙酸乙酯、甲醇、乙腈 国药集团化学试剂有限公司，分析纯；乙腈 美国飞世尔科技公司，色谱纯；鲜牛奶 安徽新希望白帝乳业有限公司，初检不含雌二醇。

Waters1525高效液相色谱系统 配有紫外检测器2489和Breeze2色谱工作站，美国Waters公司；SAM-255型微波系统 美国CEM公司；MS105DU梅特勒-托利多电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；Allegra-64R型BECKMAN离心机 美国贝克曼公司；KQ3200DE型数控超声清洗器 昆山市超声仪器有限公司；R201型旋转蒸发仪 上海申胜生物技术有限公司；HH-S恒温水浴锅 江苏国胜实验仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的制备 按5 mg/L向牛奶中分别加入雌二醇标准品，搅拌混匀，室温下静置30 min，得到样品牛奶。

1.2.2 雌二醇的微波提取工艺 准确吸取5 mL样品牛奶于三角烧瓶中，加入提取溶剂混匀，微波提取，取出后，将样液转移至离心管，以4000 r/min离心10 min，吸出上清液过无水硫酸钠后转移至旋转蒸发瓶，残渣用提取溶剂重复提取2次，上清液过无水硫酸钠后合并于旋转蒸发瓶，50℃旋蒸至近干，用5 mL提取溶剂洗涤蒸发瓶，将样液转移至浓缩管中，于50℃水浴挥发至近干，用甲醇定容至1 mL，过0.45 μm微孔滤膜，进行HPLC分析，计算提取率。

高效液相色谱条件：色谱柱：Symmetry C18柱（3.5 μm，75 mm×4.6 mm Column）；检测波长：280 nm；柱温：40℃；流速：1.0 mL/min；流动相：乙腈∶水（50∶50，V/V）；保持10 min，进样量10 μL[13]。

雌二醇提取率计算：X=S1/S2

式中：X为雌二醇提取率（%）；S1为样品牛奶中雌二醇标准品经微波提取测得的峰面积；S2为与样品中同等浓度的雌二醇标准品甲醇溶液测得的峰面积。

1.2.3 最佳提取溶剂的选择 为了选择雌二醇的最佳提取溶剂，吸取样品牛奶后，分别加入乙腈、甲醇和乙酸乙酯，按1.2.2操作，计算提取率，将提取率最高者确定为最佳提取溶剂。

1.2.4 单因素实验设计 按1.2.2雌二醇的微波提取工艺，采用乙腈作为提取剂，在固定微波功率为450 W、提取时间60 s的前提下，液料比（mL∶mL）分别为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1；在固定液料比4∶1、提取时间60 s的前提下，微波功率分别为250、350、450、550、650 W；在固定液料比4∶1、微波功率450 W的前提下，微波时间分别为20、40、60、80、100 s，考察各组实验在微波提取结束后，样品中雌二醇标准品的提取率，从而确定适宜的取值范围。

1.2.5 响应面实验设计 在单因素实验的基础上，以液料比、微波功率和微波时间为自变量，微波提取结束后，牛奶中雌二醇标准品的提取率为响应值，利用响应面分析法优化牛奶中雌二醇的微波提取工艺，因素水平如表1。

表1 响应面实验因素水平编码表Table 1 Factors and levels of the response surface experiment

1.2.6 数据统计分析 所有数据利用Microsoft Excel进行统计处理，使用Design Expert 8.0软件进行响应面实验设计，对实验数据进行回归分析，绘制响应效应图。

2 结果与分析

2.1 最佳提取溶剂的选择

由图1可知，不同种类的提取溶剂对雌二醇的提取率影响显著（p＜0.05），雌二醇在乙腈中的提取率最高，优于甲醇和乙酸乙酯，同时乙腈作为提取剂对被测组分具有良好的溶解性，又是较好的蛋白质沉淀剂[14]。因此本实验选用乙腈为牛奶中雌二醇的提取剂。

图1 不同种类提取剂对雌二醇提取率的影响Fig.1 The influence of different extraction agent on extraction yield of extradiol

2.2 单因素实验

2.2.1 液料比对雌二醇提取的影响 由图2可知，雌二醇提取率随着液料比的增加而增大，当液料比从2∶1增加到4∶1时，提取效果明显提高，这可能是因为溶剂添加量越大，越有利于雌二醇溶出，其提取率就越高。但是继续增加液料比时，由于雌二醇的提取逐渐达到平衡，此时提取率增加缓慢。综合考虑，选取液料比为4∶1。

2.2.2 微波功率对雌二醇提取的影响 由图3可知，在微波功率250～450 W范围内，雌二醇提取率随着功率的增大而提高，微波功率增加导致物质加热程度增加，蛋白质结构被破坏，与蛋白质结合的雌二醇被释放出来进入提取溶剂，从而使提取率升高[15]。但是在微波功率达到450 W之后，提取率呈下降趋势，这可能是因为高微波功率导致的热效应使雌二醇遭到破坏[4]。综合考虑，选取微波功率为450 W。

图3 微波功率对雌二醇提取率的影响Fig.3 The influence of microwave power on extraction yield of extradiol

2.2.3 微波时间对雌二醇提取的影响 由图4可知，雌二醇提取率在微波处理60 s时达到最大值。随着微波时间的延长，雌二醇提取充分，继续增加微波时间，温度升高，破坏雌二醇，提取率下降[4]。综合考虑，选取微波时间为60 s。

图4 微波时间对提取率的影响Fig.4 The influence of microwave time on extraction yield of extradiol

2.3 响应面实验结果与分析

2.3.1 响应面实验结果 以液料比、微波功率和微波时间为自变量，牛奶中雌二醇标准品的提取率为因变量，采用Box-Behnken设计原理对牛奶中雌二醇的微波提取工艺参数进行优化，实验结果见表2。

表2 响应面实验设计及结果Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

对表2中实验数据进行分析，得到响应面回归拟合方程：

Y=92.22＋1.76A＋2.37B-1.26C-2.10AB＋2.40AC＋2.75BC-2.55A2-2.15B2-2.72C2

由表3可知，所得回归方程极显著（p＜0.01），方程的决定系数R2为0.9678，校正决定系数R2Adj为0.9263，且失拟项不显著（p＞0.05），说明此方程对实验的拟合度比较好。因此所获得的二次多项模型有效，实验方法可靠，可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析和预测。微波时间对雌二醇提取率影响显著（p＜0.05），液料比与微波功率对雌二醇提取率影响极显著（p＜0.01）。液料比与微波功率、液料比与微波时间及微波功率与微波时间对雌二醇提取率均有极显著（p＜0.01）的交互影响。

表3 回归方程方差分析表Table 3 Analysis of variance for the response surface regression equation

2.3.2 实验因素交互作用分析 将其中一个因素设为零水平，其他两个因素交互作用的响应面见图5～图7所示。

由图5可知，当微波时间为60 s时，液料比和微波功率的交互作用对雌二醇提取率的影响。微波时间固定不变时，牛奶中雌二醇的提取率随着液料比的增加而升高，随着微波功率的增加呈现先增大后减小的趋势；比较曲线的变化程度，微波功率对雌二醇提取率的影响较大，曲面的倾斜度比较陡[16]。

图5 液料比与微波功率对雌二醇提取率影响的响应面图Fig.5 Response surface plot of liquid-material ratio and microwave power on extraction yield of extradiol

由图6可知，当液料比为4∶1时，微波功率和微波时间的交互作用对雌二醇提取率的影响。液料比固定不变时，牛奶中雌二醇的提取率随着微波功率与微波时间的增加均呈现先增大后减小的趋势；比较曲线的变化程度，微波功率对雌二醇提取率的影响较大，曲面的倾斜度比较陡。

图6 微波功率与微波时间对雌二醇提取率影响的响应面图Fig.6 Response surface plot of microwave power and microwave time on extraction yield of extradiol

图7 液料比与微波时间对雌二醇提取率影响的响应面图Fig.7 Response surface plot of liquid-material ratio and microwave time on extraction yield of extradiol

由图7可知，当微波功率为450 W时，液料比和微波时间的交互作用对雌二醇提取率的影响。微波功率固定不变时，牛奶中雌二醇的提取率随着液料比与微波时间的增加均呈现先增大后减小的趋势；比较曲线的变化程度，液料比对雌二醇提取率的影响较大，曲面的倾斜度比较陡。

2.3.3 模型的验证 由Design-Expert 8.0软件分析得到牛奶中的雌二醇的最佳微波提取工艺是：液料比4.1∶1、微波功率475.5 W、微波时间61.5 s，此条件下牛奶中雌二醇提取率的理论值为92.94%。考虑实际可操作性，选择液料比为4.1∶1、微波功率为475 W、微波时间为61 s，对模型进行验证实验，3次平行验证实验雌二醇提取率平均值为92.77%，与理论值接近，实际值和预测值之间相对误差较小，在可接受范围之内，说明采用响应曲面法优化牛奶中雌二醇微波提取工艺可靠，具有使用价值。

2.4 微波法与超声波法的比较

超声波法[12]提取牛奶中雌二醇，提取时间60 min、超声功率250 W、液料比1∶10、乙醇浓度80%、提取温度70℃，与本实验所得最佳提取工艺进行比较，结果见表4。与超声波法相比，利用微波法提取雌二醇，提取率高，而且微波提取法用时短，可能是因为微波法加速破坏蛋白质结构，使雌二醇游离，所以微波法提取牛奶中雌二醇效率高于超声波法。

表4 微波法与超声波法的比较Table 4 Contrast of microwave extraction method and ultrasonic extraction method

3 结论

本实验通过微波技术提取牛奶中的雌二醇，通过单因素实验以及响应面分析方法对微波提取工艺进行优化，确定微波提取牛奶中雌二醇的最佳工艺为液料比4.1∶1、微波功率475 W、微波时间61 s，在最优工艺条件下雌二醇提取率达到92.77%，该提取工艺可为今后牛奶中雌激素分析检测前处理方法提供参考。

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Optimization of microwave extraction of estradiol in milk by response surface methodology

CAO Yu-lin1，2，WU Lin-hao1，DING Guo-ying1，HU Qi-lin1，XUE Xiu-heng1，*，WANG Zhi-geng1
（1.School of Tea and Food Science&Technology，Anhui Agriculture University，Engineering Laboratory of Agricultural Products Processing of Anhui，Hefei 230036，China；2.Auhui Zhongqing Inspection and Testing Co.，Ltd.，Hefei 230088，China）

The extraction process of estradiol from milk was investigated in this paper.Based on single factor experiments，response surface methodology was used to explore the effects of liquid-material ratio，microwave power and microwave time on extraction yield of estradiol.The results showed that the optimal conditions for the extraction of estradiol were the liquid-material ratio of 4.1∶1，microwave power of 475 W，microwave time of 61 s.Under the optimal extraction conditions，the highest extraction rate of estradiol was up to 92.77%.Compared with the ultrasonic extraction method，microwave extraction method had short extraction time，high extraction yield，low energy consumption，environmental protection and other advantages.

milk；estradiol；microwave extraction；response surface methodology

TS252.7

B

1002-0306（2015）22-0252-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.044

2015－03－16

曹玉林（1990-），男，在读硕士研究生，研究方向：动物性食品加工与安全检测，E-mail：caoyulin0721@163.com。

*通讯作者：薛秀恒（1971-），男，博士，副教授，研究方向：动物性食品加工与安全检测，E-mail：xuexiuheng@126.com。

安徽省自然科学基金项目（11040606M91）；安徽省实验区和试点省专项基金项目（12z0102055）。