仪淑敏，杨立平，李学鹏，徐永霞，李颖畅，励建荣

（渤海大学食品科学研究院，渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁锦州121013）

明胶对甲醛捕获条件的研究

仪淑敏，杨立平，李学鹏，徐永霞，李颖畅，励建荣*

（渤海大学食品科学研究院，渤海大学化学化工与食品安全学院，辽宁锦州121013）

为了开发出能应用于食品中的新型甲醛捕获剂，本文以明胶为研究对象，采用单因素实验分析了时间、温度、pH、浓度对明胶与甲醛的反应特性。在单因素实验的基础上，以甲醛捕获率为响应值，通过Box-Behnken中心组合实验对明胶作为甲醛捕获剂的捕获条件进行优化，进一步研究了明胶对甲醛的捕获特性，结果表明明胶的最佳捕获条件为：捕获时间10 h、捕获温度30℃、pH8.0、明胶浓度1.0%，甲醛捕获率可达80.97%。

明胶，甲醛，捕获条件

甲醛又称蚁醛，微带酸性，具有强烈的刺激性气味，对人和动物具有较高的毒性，对神经系统、肺和肝脏均可产生损害[1]。国家标准规定甲醛不能作为食品添加剂应用于食品。但是近年来，食品中经常检测出甲醛，引起人们的广泛关注[2]。Rodriguez[3]调查了冷藏过程中的鱿鱼、鳕鱼、沙丁鱼等中甲醛本底含量，发现最高含量达41 mg/kg；Fu等[4]研究了甲醛的产生原因，发现高温作用有助于氧化三甲胺分解为甲醛和二甲胺；Herrera等[5]研究了抑制甲醛产生的途径，发现抗冻剂可抑制甲醛的产生。

甲醛捕获剂又称甲醛清除剂、甲醛消纳剂或甲醛捕捉剂，是指在一定条件下能与甲醛发生化学反应的化合物的水溶液[6]。目前甲醛捕获剂种类较多，但大多数都存在缺陷，如二次污染、影响产品性能、不适合在食品中应用等[7]，俞其林[8]发现茶多酚能够显著降低秘鲁鱿鱼丝中甲醛含量。开发出适用于食品行业的绿色新型甲醛捕获剂是当前研究热点[9]。

明胶是动物的皮、骨等通过部分酸法、碱法水解或酶解，提纯而获得的胶原蛋白[10]。是一种将胶原三螺旋结构转化为无规则链而获得的蛋白质，具有生物可降解性及良好的生物相容性[11]，因此在医药与食品上得到广泛的应用。Fahmi等[12]曾利用海鲷鱼明胶制备血管紧张素转换酶活性抑制肽，任龙芳等[13]比较了明胶、骨胶和氨基酸的除醛效果，其中明胶的甲醛去除率最高，达到50%。本实验对明胶捕获甲醛的条件进行了优化，为开发出适用于食品的甲醛捕获剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

明胶 化学纯，国药集团化学试剂有限公司；乙腈 色谱纯，天津市天立化学试剂有限公司；2，4-二硝基苯肼（DNPH） 分析纯，天津市东丽区天大化学试剂厂；甲醇 色谱纯，TEDIA公司；甲醛标准溶液 分析纯，国家环保总局；37%～40%甲醛溶液 分析纯，沈阳市华东试剂厂。

Agilent HPLC1260高效液相色谱仪 美国安捷伦科技公司；1004精密电子天平 上海恒平科学仪器有限公司；DK-8D型电热恒温水槽 上海一恒科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 明胶与甲醛溶液的反应 将37%～40%的甲醛溶液以适量倍数稀释（约为10 μg/mL，以甲醛标准溶液浓度为参照），再将明胶配制成一定质量分数的溶液，以甲醛溶液和明胶溶液体积比（v/v）2∶1混合，用NaOH或HCl溶液调pH，摇匀，一定条件反应，反应后定容，充分摇匀。移取样品溶液4 mL，测定残余甲醛含量。每次实验重复三次，同时用蒸馏水代替明胶做空白对照实验。

1.2.2 单因素实验设计

1.2.2.1 反应时间对甲醛与明胶反应的影响 取5 mL 1.0%（w/v）的明胶溶液和10 mL的甲醛溶液于25 mL的具塞比色管中，在25℃条件下，考察反应时间0、3、6、9、12 h对明胶与甲醛溶液反应的影响。

1.2.2.2 反应温度对甲醛与明胶反应的影响 取5 mL 1.0%（w/v）的明胶溶液和10 mL的甲醛溶液于25 mL的具塞比色管中，在4、20、40、60、80℃水浴中反应12 h，考察反应温度对明胶与甲醛溶液反应的影响。

1.2.2.3 pH对甲醛与明胶反应的影响 取5 mL 1.0%（w/v）的明胶溶液和10 mL的甲醛溶液于25 mL的具塞比色管中，在20℃水浴中反应12 h，考察pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0对明胶与甲醛溶液反应的影响。

1.2.2.4 明胶浓度对甲醛与其反应的影响 取5 mL不同浓度的明胶溶液（0.2%、0.5%、0.8%、1.0%、5.0%、10.0%，w/v）和10 mL的甲醛溶液于25 mL的具塞比色管中，在pH为8.0，温度为20℃的水浴中反应12 h，考察明胶浓度对其与甲醛溶液反应的影响。

1.2.2.5 响应面实验设计 在单因素实验的基础上，为进一步研究时间、温度、pH和明胶浓度对明胶与甲醛反应的影响，设计了4因素3水平的组合实验，考察时间、温度、pH和明胶浓度4个因素对甲醛捕获率的影响。实验设计如表1。

表1 响应面分析因素与水平表Table 1 Factors and levels for RSD

1.2.3 甲醛检测方法 根据励建荣等建立的方法[14]略有改进，利用高效液相色谱法测定甲醛含量，甲醛与DNPH于60℃水浴衍生生成2，4-二硝基苯腙，经ODS-C18柱分离，紫外检测器于波长355 nm下检测，以保留时间定性，峰面积定量，间接测出甲醛含量。测定时取4 mL样品溶液，加入DNPH衍生剂2 mL，60℃下衍生30 min，流水冷却，0.45 μm滤膜过滤后，取10 μL进样检测。

1.2.4 甲醛标准曲线的绘制 分别取10 μg/mL的甲醛标准液0.00、0.20、0.40、0.80、1.20、2.00 mL于10 mL具塞比色管中，加蒸馏水至4.0 mL。加入0.5 mg/mL的DNPH 2 mL，于60℃水浴中放置30 min，然后在流水中快速冷却，用0.45 μm滤膜过滤后，取10 μL进样，测量保留时间和峰面积，每种浓度测定三次，取平均值，用峰面积和甲醛含量绘制标准曲线。

1.2.5 甲醛捕获率的计算 甲醛捕获率（%）=（A-X）/A×100；式中：A-甲醛原始含量，μg/mL；X-样品中甲醛含量，μg/mL。

1.3 数据处理

利用SPSS 18.0的ANOVA作方差分析，差异显著性p＜0.05；由Design-Expert 8.0.6软件进行响应面分析。

2 结果与讨论

2.1 甲醛标准曲线

对实验结果进行回归统计，得出甲醛标准曲线线性回归方程：Y=243.62X+4.00，R2=0.9995。

图1 甲醛标准曲线Fig.1 The standard curve of formaldehyde

2.2 单因素实验结果

2.2.1 反应时间对甲醛与明胶反应的影响 随着反应时间的延长，甲醛捕获率显著增加（p＜0.05）。反应9 h内，甲醛减少量显著，当反应时间分别为9 h和12 h时，甲醛捕获率分别为56.47%和59.34%，甲醛的减少趋于平缓，可能是因为反应时间较短时，捕获剂上的羧基未得到活化，阻碍了反应的顺利进行，而当反应进行一段时间后，氨基的数量已达到饱和状态，所以甲醛捕获率也相应地达到最大值[15]。

图2 时间对甲醛与明胶反应的影响Fig.2 The effect of time on reaction of formaldehyde with gelatin

2.2.2 反应温度对甲醛与明胶反应的影响 4℃时明胶与甲醛的反应活性最低，甲醛的减少量不显著；随着温度的升高，相邻处理间甲醛减少量的差异显著（p＜0.05），且温度为20℃时，甲醛捕获率达到最大值72.60%，随着温度升高甲醛捕获率逐渐减少，由此可见较高温度不利于明胶与甲醛发生反应，这可能是明胶自身的羧基和氨基在较高温度下容易发生自身交联，减少了氨基与甲醛的结合[15]。因此在实际应用时，可采用20℃左右使甲醛捕获率达到较好值。

图3 温度对甲醛与明胶反应的影响Fig.3 The effect of temperature on reaction of formaldehyde with gelatin

2.2.3 pH对明胶与甲醛反应的影响 在pH1.0～8.0范围内，随着pH的增大，甲醛减少量显著增加（p＜0.05），当pH为8.0时甲醛捕获率达到72.13%；在pH8.0～10.0范围内，随着pH的增大，甲醛捕获率显著减少（p＜0.01）；但随着pH的进一步增大，甲醛含量又相应减少，这是由于甲醛在碱性条件下发生歧化作用，一分子甲醛被氧化成甲酸，另一分子甲醛被还原成甲醇，该反应亦被称为卡尼查罗（Cannizzaro）反应[16]。由此可见，pH对甲醛与明胶反应影响较大，在实际应用时可采取偏中性环境。

图4 pH对明胶与甲醛反应的影响Fig.4 The effect of pH on reaction of formaldehyde with gelatin

2.2.4 明胶浓度对甲醛与其反应的影响 明胶与甲醛溶液在20℃、pH8.0的条件下反应12 h，不同浓度的明胶溶液与甲醛反应结果见图5。可以得出明胶浓度对甲醛捕获率有显著性影响（p＜0.05），浓度由0.2%升到0.8%时，甲醛捕获率显著增加（p＜0.01），再随着浓度升高，明胶与甲醛的反应将趋于平衡，可能是由于高浓度的明胶溶液本身容易发生交联，阻止了明胶与甲醛的反应。因此实验时可选用0.8%左右的明胶溶液，参考图5，本实验选取0.5、1.0、1.5进行响应面实验。

图5 明胶浓度对甲醛与其反应的影响Fig.5 The effect of concentration on reaction of formaldehyde with gelatin

表2 Box-Behnken实验设计与结果Table 2 Design and results of Box-Behnken experiment

2.3 响应面优化明胶捕获甲醛的条件

设计4因素3水平的组合实验，考察温度、时间、pH和明胶浓度四个因素对明胶与甲醛反应的影响，实验设计及结果见表2，甲醛捕获率最高值可达82.12%。对实验数据进行响应面多元回归拟合，方差分析结果见表3。

表3 方差分析结果Table 3 Variance analysis results

由方差分析结果可知，模型F值为11.19，p＜0.0001，表明模型极显著，说明使用该方程模拟4因素3水平的分析是可行的；失拟项F值为4.08，表明失拟项与净误差的发生是不显著的，其中9.38%的发生机会是由于噪音引起的，失拟项不显著表明这个模型是合理的；回归方程的相关系数R2=0.9180，说明响应值的变化有91.80%来源于所选变量，即甲醛捕获率的变化有91.80%的原因来源于时间、温度、pH、明胶浓度。在这个模型中B、C、D、AD、BD、B2对甲醛的捕获影响显著，说明温度、pH、明胶浓度及时间与明胶浓度的交互作用、温度与明胶浓度的交互作用对明胶与甲醛反应的影响较大。在四种因素的交互作用下，各因素对甲醛捕获率的影响顺序是B＞C＞D＞A，即温度＞pH＞明胶浓度＞时间。因此，该回归方程可以较好地描述各因素与响应值之间的真实关系，可以用其确定最佳捕获条件。

图6和图7为响应面曲面图，从曲面图可以看出时间对甲醛捕获率的影响不显著；温度对甲醛捕获率的影响是随着温度的升高先升高，再降低，在30～40℃时达到最大值；明胶浓度在中心组合选取的范围内是随着浓度的变大，甲醛捕获率也随之变大。经过软件优化实验的最终理论值为：捕获时间10.60 h、捕获温度30.89℃、pH7.93、明胶浓度1.28%，甲醛捕获率为83.07%。考虑到实际操作，将以上条件校正为捕获时间10 h、捕获温度30℃、pH8.0、明胶浓度1.0%，验证实验表明此时甲醛捕获率为80.97%，与理论值较一致。

3 结论

单因素结果表明反应时间、温度、pH及明胶浓度均可显著影响明胶对甲醛的捕获率。

图7 温度与浓度曲面图Fig.7 The surface figure of temperature and concentration

响应面分析确定了明胶对甲醛捕获的最佳条件：捕获时间10 h、捕获温度30℃、pH8.0、明胶浓度1.0%，甲醛捕获率为80.97%。其中温度对反应影响最显著，其次是pH、明胶浓度，时间最小。

实验结果表明明胶捕获甲醛效果显著，该方法对食品中的甲醛捕获有良好的应用前景。但是在添加过程中应合理控制食品存放环境的温度和时间，防止食品变质，影响到产品的其他品质。

[1]Henry D H，Casanova M.The implausibility of leukemia induction by formaldehyde：a critical review of the biological evidence on distant-site toxicity[J].Regulatory Toxicology and Pharmacology，2004，40（2）：92-106.

[2]马敬军，周德庆，柳淑芳，等.二硝基苯肼衍生-高效液相色谱法测定水产品中甲醛含量的研究明[J].海洋水产研究，2005，26（1）：28-31.

[3]Rodriguez.Studies on the principal degration products of trimethylamine oxide in four species of refrigerated fish[J].Food and Food Chemistry，1997，288：131-135.

[4]Fu X Y，Xue C H，Miao B C，et al.Effect of processing steps on the physico-chemical properties of dried-seasoned squid[J]. Food Chemistry，2007，103：287-294.

[5]Herrera J J，Pastoriza L，Sampedro G，et al.Effect of various cryostabilizers on the production and reactivity of formaldehyde in frozen-stored minced blue Whiting muscle[J].Journal ofAgriculture and Food Chemistry，1999，47：2386-2397.

[6]曲芳，兰拓，张晓芳，等.人造板用甲醛捕捉剂[J].木材加机械，2005（4）：29-32.

[7]吴东晓，杨文鸽，徐大伦，等.食用明胶的酶解及其酶解物的甲醛捕获特性研究[J].核农学报，2013（5）：658-662.

[8]俞其林.茶多酚作力甲酸捕获剂的反应特性及在鱿鱼制品中的应用研究[D].杭州：浙江工商大学，2007.

[9]张换换，刘浪浪，刘军海.甲醛捕捉剂的研究热点和发展方向[J].中国环保产业，2010（1）：51-54.

[10]陈海华.明胶的凝胶特性及多糖对明胶凝胶特性的影响[J].粮油加工，2009（5）：130-134.

[11]Ward A G，Courts A.The Science and technology of gelatin [M].Academic Press，1977：241.

[12]Fahmi A，Morimur S，Guo H C，et al.Production of angiotensin I converting enzyme inhibitory peptides from sea bream scales[J].Process Biochemistry，2004，39（12）：1195-1200.

[13]任龙芳，王学川.蛋白类甲醛捕获剂除醛效果的对比研究[J].皮革科学与工程，2010，20（4）：15-17.

[14]Li J R，Zhu J L，Ye L F.Determination of formaldehyde in squid by high-performance liquid chromatography[J].Asia Pacific Journal of Clinical Nutrition，2007，16（S1）：127-130.

[15]任龙芳.基于废弃皮胶原改性的甲醛捕获剂的制备及其捕获行为的研究[D].陕西：陕西科技大学，2011.

[16]周永香.多功能游离甲醛捕获剂的研制[D].陕西：陕西科技大学，2006.

Capture conditions of gelatin with formaldehyde

YI Shu-min，YANG Li-ping，LI Xue-peng，XU Yong-xia，LI Ying-chang，LI Jian-rong*
（College of Chemistry，Chemical Engineering and Food Safety，Bohai University，Jinzhou 121013，China）

In order to develop a new type of formaldehyde capture agent used in food，the characteristics of gelatin with formaldehyde reaction were investigated under time，temperature，pH value and the concentration of gelatin in this paper.Based on single factor test，the Box-Benhnken central composite experimental test was designed by using optimum range for the reactivity of gelatin as formaldehyde scavenger with formaldehyde. The results showed that the optimum gelatin capture conditions：capture time 10 h，trapping temperature 30℃，pH value of 8.0，gelatin concentration 1.0%，formaldehyde capture rate of 80.97%.

gelatin；formaldehyde；capture conditions

TS254.1

B

1002-0306（2015）22-0227-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.039

2015-02-05

仪淑敏（1980-），女，博士，副教授，主要从事水产品贮藏加工及质量安全控制方面的研究，E-mail：yishumin@163.com。

*通讯作者：励建荣（1964-），男，博士，教授，主要从事水产品、果蔬贮藏加工及安全控制方面的研究，E-mail：lijr6491@163.com。

“十二五”国家科技支撑计划课题（2012BAD29B06；2015BAD17B01）；国家自然基金（31301418，31201308）；辽宁省食品安全重点实验室；辽宁省高校重大科技平台；辽宁省高等学校创新团队；辽宁省高等学校攀登学者支持计划。