曹 江，邹孝强，金青哲，王兴国

（食品科学与技术国家重点实验室，食品安全与营养协同创新中心，江南大学食品学院，江苏无锡214122）

改性巴沙鲶鱼油制备1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯的研究

曹 江，邹孝强*，金青哲，王兴国

（食品科学与技术国家重点实验室，食品安全与营养协同创新中心，江南大学食品学院，江苏无锡214122）

以巴沙鲶鱼油为原料采用酶法酸解制备1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯（OPO）。首先将巴沙鲶鱼油在30℃下分提，富集鲶鱼油中富含sn-2棕榈酸的部分，再以sn-1，3位选择性脂肪酶Lipozyme RM IM为催化剂，以高油酸葵花籽油脂肪酸为酰基供体，在填充床反应器中酸解鲶鱼油分提物，制备得到富含OPO的产品。酸解反应的优化条件为：停留时间1 h，鱼油与脂肪酸的比值1∶6（摩尔比），反应温度50℃，水分含量3.5 wt%。在此条件下，所得产品的sn-2棕榈酸含量为57.8%，sn-1，3油酸含量为78.7%。

1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯，巴沙鲶鱼油，填充床反应器，Lipozyme RM IM

母乳是婴幼儿的最佳食物，提供包括婴幼儿所需的几乎所有营养物质。脂肪占母乳的3%～5%左右，为婴幼儿提供50%以上的能量[1]。这些脂肪中，甘油三酯含量在98%以上。人乳中棕榈酸含量为20%～30%，大多数饱和脂肪酸在甘油三酯的sn-2位，而不饱和脂肪酸在sn-1，3位，因此，形成了大量以1，3位二不饱和脂肪酸2位饱和脂肪酸甘油三酯（USU）形式存在的甘油三酯，如1，3-二油酸-2-棕榈酸甘油三酯（OPO）。婴幼儿摄入的脂肪大约有10%～30%会首先通过舌脂酶以及胃脂酶水解成为sn-1，2甘油二酯，然后再通过胰脂酶及胆盐的作用最后水解成为单甘酯和脂肪酸[2]。sn-2单甘酯可以直接通过小肠上皮细胞吸收再转变成为甘油三酯。这些甘油三酯转化为乳糜微粒运送到身体各部位提供能量。脂肪酸的吸收同其饱和度及链长有重要关系。长链饱和脂肪酸容易同体内的钙镁离子形成高熔点的皂，排出体外[3]。对于婴幼儿来说，这样会导致能量的损失，同时还可能导致便秘[4-5]。因此，棕榈酸位于sn-2位将有利于甘油三酯的吸收。同时，Aoe等[6]研究了OPO和1-棕榈酸-2，3-二油酸甘油三酯（POO）两种同分异构体对于婴儿淋巴乳糜微粒的影响，由OPO形成的乳糜微粒的平均粒径要大于由POO的平均粒径，说明OPO的运输效率比POO更高。因此，这种结构的甘油三酯，对婴幼儿体内的吸收效率，代谢都有重要意义。

相关文献报道了采用三棕榈酸甘油酯及猪油制备OPO产品的方法[7-9]。棕榈硬脂虽然在sn-2位上有棕榈酸，但是其在sn-1，3位也含有大量的棕榈酸。因此，制备OPO产品需要采用大的底物比。猪油虽然同人乳脂肪的结构比较相似，在sn-2位有较高的棕榈酸含量，但是有一定宗教限制，因而不能得到通用。因此，找到一种在sn-2位有较高棕榈酸含量又具有较低总棕榈酸含量的油脂，对于开发OPO产品具有极为重要的意义。基于这样的目的，通过对大量油脂分析发现，一些鲶鱼油总棕榈酸含量为30%左右，大约有40%以上的棕榈酸在sn-2位，是制备OPO的良好原料。

因此，本研究以巴沙鲶鱼油为原料，通过先分提，富集鲶鱼油中富含sn-2棕榈酸的部分，再在填充床反应器中酶法酸解分提鲶鱼油，制备得到富含OPO的产品，以期为生产实践提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

Lipozyme RM IM 诺维信（中国）投资有限公司；猪胰脂酶及Supelco 37种脂肪酸甲酯混标 Sigma-Aldrich（上海）贸易有限公司；TLC硅胶板60G（10 cm× 20 cm） 烟台江友硅胶有限公司；色谱纯的正己烷、异丙醇和甲醇 百灵威科技有限公司；乙醚三氟化硼溶液、浓硫酸、冰醋酸和乙醚 国药化学试剂上海有限公司；巴沙鲶鱼油（BCFO） 中海海洋科技有限公司；高油酸葵花籽油 益海嘉里集团。

AR2140电子精密天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；SHA-CA水浴恒温振荡器 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；HH-4数显恒温水浴锅 江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司；XW-80A微型旋涡混合仪 上海沪西分析仪器厂；RE-52旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器厂；SHB-B95型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；TGL-16B离心机 上海安亭科学实验仪器厂；GC-14B气相色谱仪 日本Shimadzu公司；KDL1型分子蒸馏设备 德国UIC公司。

1.2 实验方法

1.2.1 游离脂肪酸的制备 游离脂肪酸的制备参考Senenayeke的方法[10]：向25 g油中加入5.75 g KOH，11 mL蒸馏水和66 mL 95%的乙醇，在80℃和200 r/min下冷凝回流反应1 h。冷却后，向体系中加入50 mL的蒸馏水和100 mL的正己烷，充分振荡后，除去含有未皂化物的有机相。采用3 mol/L盐酸溶液调节含有皂化物的无机相至pH为1，释放脂肪酸。最后采用无水Na2SO4对所得游离脂肪酸进行脱水处理。

1.2.2 鱼油的分提 将巴沙鲶鱼油置于60℃下完全熔化，并保留30 min，然后再将其置于30℃下结晶12 h。将结晶的巴沙鲶鱼油通过真空过滤，得到固脂和液油。

1.2.3 填充床酶反应器的设置 填充床酶反应器按照Xu等的报道进行设置[11]，如图1所示。该反应器是一个夹套的玻璃柱，尺寸为20 mm（i.d.）×24 cm（l），其中装有25 g的Lipozyme RM IM（表观密度为400 kg/m3），酶柱的上方和下方均塞上玻璃棉，同时整个玻璃柱由铝箔包裹。在将反应底物通入之前，首先通入氮气排除柱中的空气。反应底物保留在水浴中以便控制温度，同时采用蠕动泵将其抽入酶柱中，通过向夹套中通入循环水控制其温度。

图1 填充床反应器示意图Fig.1 Process diagram of an enzyme bed reactor

1.2.4 填充床操作性质的确定 向填充床反应器中以1 mL/min的速率通入中碳链甘油三酯，然后再向其中通入反应底物以取代酶柱中的中碳链甘油三酯。通过监测混合物中的中长碳链脂肪酸相对含量的变化研究填充床反应器的操作性质。

1.2.5 底物停留时间的测定 分别称量未通过底物及通过底物填充床酶柱的质量，确定酶柱可容纳底物的质量（M），结合反应底物的密度（ρ），可计算得到酶柱中底物的体积（Vs=M/ρ）。底物在酶柱中的停留时间为Vs/vf，其中vf为底物的流速。

1.2.6 酶解反应条件的确定

1.2.6.1 停留时间对反应的影响 选择在底物比为1∶4，反应温度为60℃，水分含量为3.5 wt%的条件下，研究停留时间为0.5、1.0、1.5及2.0 h时产物中sn-2位棕榈酸及sn-1，3位油酸含量的变化。

1.2.6.2 底物比对反应的影响 选择在停留时间为1 h，温度为60℃，水分含量为3.5 wt%的条件下，研究底物比为1∶2、1∶4、1∶6以及1∶8时产物中sn-2位棕榈酸及sn-1，3位油酸含量的变化。

1.2.6.3 温度对反应的影响 选择在停留时间为1 h，底物比为1∶6，水分含量为3.5 wt%的条件下，研究反应温度为40、50、60、70℃时产物中sn-2位棕榈酸及sn-1，3位油酸含量的变化。

1.2.6.4 水分含量对反应的影响 选择在停留时间为1 h，反应温度为50℃，底物比为1∶6的条件下，研究水分含量为3.5、7.0、10.5以及14.0 wt%时产物中sn-2位棕榈酸及sn-1，3位油酸含量的变化。

1.2.7 脂肪酸分析

1.2.7.1 脂肪酸组成分析 脂肪酸组成分析采用配备火焰离子化检测器的GC-14B气相色谱仪，所用分析柱为熔融石英毛细管柱（PEG-20M，30 m×0.32 mm× 0.5 μm）。所用条件为：100℃保留4 min，并以15℃/min程序升温至180℃，然后在180℃保留4 min，并最终以4℃/min升温至215℃。进样口及检测器的温度均为250℃。通过标准品的保留时间来鉴定脂肪酸种类。脂肪酸的相对含量表示为mol%。

1.2.7.2 甘油三酯的分离 取50 μL样品，采用TLC薄板分离纯化得到甘油三酯，所用的扩展液为：正己烷/乙醚/乙酸（80∶20∶1，v/v/v）[12]。在薄板上均匀喷洒0.2 wt%的2，7二氯荧光素的甲醇溶液并进行紫外显色处理。将相应的甘油三酯带刮下并置于10 mL密封瓶中，向其内加入4 wt%的硫酸甲醇溶液，冲入氮气，旋盖密封，在90℃下酯化20 min。酯化结束后，向瓶内加入2 mL正己烷，提取所得的脂肪酸甲酯。取出上层有机相并采用无水Na2SO4进行脱水处理，最后采用氮气浓缩有机相至200 μL，进行气相分析。

1.2.7.3 胰脂酶水解 根据Luddy等的方法对采用薄层色谱法分离获得的甘油三酯进行水解获得sn-2单甘酯[13]。采用2 mL乙醚提取1.2.5所获得的甘油三酯带2次，并用氮气进行浓缩。向甘油三酯中加入1 mL的1 mol/L Tris-HCl缓冲液（pH8.0），0.05%胆盐0.25 mL，0.1 mL的2.2%的氯化钙以及10 mg胰脂肪酶，在40℃下振荡反应3 min，然后向体系中加入1 mL 6mol/L的盐酸和2 mL乙醚，振荡后以10000 r/min离心5 min。取出乙醚层，并用无水Na2SO4对其进行脱水处理，采用氮气将其浓缩至200 μL。将水解产物上样至薄板，并用正己烷/乙醚/乙酸（50∶50∶1，v/v/v）的扩展液分离获得2-单甘酯。2-单甘酯的甲酯化参照1.2.5所述进行。

1.2.8 分子蒸馏脱除脂肪酸 采用分子蒸馏除去反应体系中的游离脂肪酸，其条件为：蒸发器温度，185℃；冷凝器温度，40℃；换热器温度，60℃；旋转刮膜速率，120 r/min；进料速度，2 mL/min，绝对压力，2 Pa。蒸发器的加热源来自于夹套中循环的加热硅油。

1.2.9 熔点的测定 熔点测定参照GB/T 24892-2010《动植物油脂在开口毛细管中熔点（滑点）的测定》。

1.2.10 数据处理 采用Microsoft Excel 2010进行数据处理，文中报道的数据均为三次测定后的平均值。

2 结果与讨论

2.1 巴沙鲶鱼油的分提

巴沙鲶鱼油在30℃下结晶分提之后固脂及液油部分的脂肪酸组成及分布的气相色谱图如图2所示，含量如表1所示。固脂部分中的总棕榈酸含量由32.8%升高至34.6%，sn-2位棕榈酸含量由49.3%升高至60.4%，总油酸含量由38.9%降至37.3%，sn-1，3油酸含量由45.2%升高至46.6%；在液油中，总棕榈酸和sn-2棕榈酸含量均有所下降，总油酸含量有所提高。对于其他脂肪酸而言，固脂中的饱和脂肪酸均有所提高，而不饱和脂肪酸均有所降低，液油的情况相反。由此可见，经过分提之后的巴沙鲶鱼油的固脂部分由于其更高的sn-2位棕榈酸含量，更加适合于富含OPO产品的生产。

图2 巴沙鲶鱼油、分提固脂及液油的脂肪酸组成及分布气相图谱Fig.2 GC chromatogram of the fatty acid composition and distribution of basa catfish oil,solid and liquid fractions

2.2 填充床反应器性质的确定

填充床反应器的洗脱曲线如图3所示。长链脂肪酸的浓度在30 min时迅速增加，而中碳链脂肪酸迅速降低，说明填充床反应器的死体积是30 mL，在96 min时，长链脂肪酸达到最高浓度，同时中碳链脂肪酸达到最低。由此可知，开始一个新实验时，第一个96 mL的洗脱液应该去掉，以避免残留底物的影响。

表1 巴沙鲶鱼油及其分提物的脂肪酸组成及分布（%）Table 1 Fatty acid composition and distribution of basa catfish oil and its fractions（%）

图3 填充床反应器的洗脱曲线Fig.3 The elution curves of the continuous packed-bed reactor

2.3 填充柱反应条件的确定

2.3.1 停留时间的影响 图4表示的是在底物比为1∶4，反应温度为60℃时，停留时间对填充床反应器中酸解反应的影响。酶催化的酸解反应是可逆反应[14]。反应从开始到最终的反应平衡需要一定时间。但是，时间越长，体系中酰基转移量就越多，从而降低反应物的纯度，增加副产物。当停留时间在1 h以内时，反应产物中的sn-1，3位油酸含量随着时间的增加而不断增加，当停留时间增加至1 h时，棕榈酸含量达到最大，为74.0%，当反应超过1 h，sn-1，3位油酸含量变化不大。由此说明，酸解反应经过1 h后达到平衡。

产物中sn-2位棕榈酸含量主要是受酰基转移的影响。酶催化的酸解反应是一个两步可逆反应，首先底物在酶的催化下水解成sn-1，2，（23）甘油二酯，然后体系中的游离脂肪酸再在脂肪酶的作用下同甘油二酯发生酯化反应，重新生成甘油三酯。中间产物sn-1，2，（23）甘油二酯不稳定，容易发生酰基转移生成sn-1，3甘油二酯，从而影响最终产物的纯度。反应时间越长，酰基转移量越大。由图4可知，sn-2棕榈酸含量随停留时间的延长而不断降低。当停留时间在1 h时，sn-2棕榈酸含量为58.5%，而当停留时间升高至2 h时，sn-2棕榈酸含量降低至56.1%。因此，较短的停留时间将有利于提高产品的质量。经综合考虑，酶填充床反应器中酸解巴沙鲶鱼油分提物的停留时间选择为1h。

图4 停留时间对填充床反应器中酶催化酸解反应的影响Fig.4 The effect of residence time on the acidolysis reactions in packed-bed reactor

2.3.2 底物比的影响 图5表示的是在停留时间为1 h，温度为60℃，水分含量为3.5 wt%的条件下，体系中鲶鱼油同脂肪酸的比例对填充床反应器中酸解反应的影响。底物比决定了酸解反应中平衡最终所能达到的程度。较高的底物比，将有利于平衡向正反应方向移动，但是高底物比将会增加经济成本同时为后续的脱酸带来困难[15]。

图5 底物比对填充床反应器中酶催化酸解反应的影响Fig.5 The effect of substrate ratio on the acidolysis reactions in packed-bed reactor

由图5可知，随着底物比的增加，产物中sn-1，3位油酸含量不断增加，但是增加速率不断降低。当底物比由1∶4增加至1∶6时，产物中sn-1，3位油酸含量由74.0%增加至78.3%，增加量为4.3%；而当底物比由1∶6增加至1∶8时，产物中sn-1，3油酸含量由78.3%增加至79.2%，增加量仅为0.9%。产物中sn-2位棕榈酸含量随着底物比的增加而不断降低，主要原因可能是底物中较高的游离脂肪酸含量增加了体系中的酸度，从而增加了酰基转移的速率。综合以上分析，实验选择的底物比为1∶6。

2.3.3 温度的影响 图6表示的是在停留时间为1 h，底物比为1∶6，水分含量为3.5 wt%的条件下，不同反应温度对填充床反应器中酶催化酸解反应的影响。较高的温度可以提高反应物中的分子运动速度，增加反应物的有效碰撞，从而提高反应速率，减少反应达到平衡所需的时间，提高填充床反应器的工作效率。但是较高的反应温度，同时也会增加酰基转移的速率，从而降低反应物的纯度。

由图6可知，当温度由40℃上升至50℃时，反应物中的sn-1，3位油酸含量由74.8%上升至78.0%，当温度高于50℃时，sn-1，3位油酸含量变化不大。由此可知，在此条件下，当反应温度为50℃，反应即达到平衡。产物中的sn-2位棕榈酸含量随着温度增加而不断降低。当温度由40℃上升至50℃时，sn-2位棕榈酸含量由59.5%下降至59.0%，降低量为0.5%；而当温度由60℃上升至70℃时，sn-2位棕榈酸含量由58.1%下降至57.1%，降低量为1%。因此，为提高反应效率及降低酰基转移量，实验选择的反应温度为50℃。

图6 温度对填充床反应器中酶催化酸解反应的影响Fig.6 The effect of temperature on the acidolysis reactions in packed-bed reactor

2.3.4 水分含量的影响 酶催化的酸解反应需要一定量的水分。在合适的含水量范围内，高水分含量将提高反应效率，降低反应达到平衡所需时间。但是，当水分含量过高时，体系中将会有较多的甘油三酯被水解，从而降低中性油的得率。

图7表示的是在停留时间为1 h，反应温度为50℃，底物比为1∶6时，不同水分含量对填充床反应器中酶催化酸解反应的影响。随着水分含量的增加，sn-1，3位油酸含量的变化不大，但是sn-2位棕榈酸含量却不断降低。增加体系中的水分含量，将会增加反应体系中因水解而产生的甘油酯含量，从而了增加酰基转移的量。因此，为控制体系中的酰基转移以及提高中性油的得率，实验选择的水分含量为脂肪酶的原始水分含量，即3.5 wt%。

图7 水分含量对填充床反应器中酸解反应的影响Fig.7 The effect of water content on the acidolysis reactions in packed-bed reactor

综上所述，填充床反应器中酶催化酸解巴沙鲶鱼油分提物的优化条件为：停留时间1 h；底物比1∶6；反应温度50℃；水分含量3.5 wt%。在此条件下，所得酸解产物的脂肪酸组成及分布如表2所示。

表2 优化条件下酸解产物的脂肪酸组成及分布（%）Table 2 Fatty acid composition and distribution of enzymatic product under optimized conditions（%）

由表2可知，在优化条件下，酶催化酸解产物的棕榈酸含量由固脂中的34.6%降低至22.4%，sn-2位棕榈酸含量由60.4%降低至57.8%，油酸含量由37.3%升高至60.1%，sn-1，3油酸含量由46.6%升高至78.7%。所得产物的熔点由33.5℃降低至14.8℃。

3 结论

根据巴沙鲶鱼油的脂肪酸组成及分布特点，以高油酸葵花籽油脂肪酸为酰基供体，在填充床反应器中采用1，3位特异性脂肪酶Lipozyme RM IM酸解巴沙鲶鱼油分提物，成功制备得到富含OPO的产品。酸解反应的优化条件为：停留时间1 h，鱼油与脂肪酸的比值1∶6（摩尔比），反应温度50℃，水分含量3.5 wt%。在此条件下，所得产品的sn-2棕榈酸含量为57.8%，sn-1，3油酸含量为78.7%，熔点为14.8℃。

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Modification of basa catfish oil for preparation of 1，3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol

CAO Jiang，ZOU Xiao-qiang*，JIN Qing-zhe，WANG Xing-guo
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Synergetic Innovation Center of Food Safety and Nutrition，School of Food Science and Technology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

Basa catfish oil with a high content of sn-2 palmitic acid and low content of total palmitic acid was a good raw material for preparation of 1，3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol（OPO）.In this study，Basa catfish oil was fractionated under 30℃ to enrich the fat fraction with higher content of sn-2 palmitic acid，and then the OPO product was prepared by acidolysis of the fat fraction with free fatty acids from high oleic acid sunflower oil using sn-1，3 specific lipase，Lipozyme RM IM，in a packed-bed reactor.The conditions of acidolysis reaction were optimized as follows residence time 1 h，substrate molar ratio 1∶6（fish oil/free fatty acid），reaction temperature 50℃，water content 3.5 wt%.Under these conditions，the product had 57.8%palmitic acid at sn-2 position and 78.7%oleic acid at sn-1，3 positions.

1，3-dioleoyl-2-palmitoylglycerol；basa catfish oil；packed-bed reactor；Lipozyme RM IM

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0216-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.037

2015－01－29

曹江（1993-），男，硕士研究生，研究方向：脂质科学与技术，E-mail：cc199318@sina.com。

*通讯作者：邹孝强（1983-），男，博士，副教授，研究方向：脂质科学与技术，E-mail：xiaoqiangzou@163.com。

江南大学自主科研计划-青年基金（JUSRP11439）。