史 辉，唐俊妮，陈 娟，龙 虎，蒋 梅，王文娅

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041）

成都市武侯区肉类食品大肠杆菌污染状况及毒力基因调查

史 辉，唐俊妮，陈 娟*，龙 虎，蒋 梅，王文娅

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川成都610041）

了解成都市武侯区肉类食品中大肠杆菌污染情况和分离菌株的毒力特征，以预防和控制食品污染，保证食品安全。2011～2013年间采集成都市武侯区超市和菜市场的肉类食品，经选择性培养与分离鉴定，采用PCR方法检测8种相关毒力基因（eaeA、stx1A、stx2A、hlyA、aggR、est、eltA和bfpA）的流行情况。结果表明生肉类中大肠杆菌的检出率为81.07%，熟肉类中大肠杆菌的检出率为40%；在分离的324株大肠杆菌中有49株检测到一种及以上毒力基因；主要流行的毒力基因是eaeA和aggR，未检测到est和bfpA基因。通过本研究发现成都市武侯区肉类食品中大肠杆菌污染比较严重，大肠杆菌携带毒力基因以eaeA和aggR为主，该结果反映本市肉类产品的卫生安全状况，可为成都地区食品源大肠杆菌控制及毒力基因流行提供科学数据。

肉类食品，大肠杆菌，污染状况，毒力基因

肉类产品是人们日常生活的主要食用消费品。随着人们对食品安全意识不断提升，肉类产品的安全性也越来越受到关注。肉类产品被微生物污染后可能会引起腐败变质和食源性疾病，从而影响肉类质量与安全。畜体在屠宰、运输和贮藏过程中，因为污染微生物的生长繁殖导致产品的腐败，一直是困扰生产者的一个重要问题，同时引发的肉品安全问题也是消费者最为关注的核心[1-3]。大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）作为食品卫生程度的重要指示菌，在肉类产品中污染现状严峻。近年来对食品中大肠杆菌的监测与分析表明肉类产品是受大肠杆菌污染的主要食品品种，并且污染率高[4-6]。部分研究显示大肠杆菌不仅污染程度大，而且菌株具有多样性，其携带的毒力基因存在一定流行特征[7-9]。

本研究针对2011年～2013年间成都市武侯区的超市和菜市场的肉类食品大肠杆菌污染情况和毒力基因进行调查与分析，为有关部门的监测和管理提供参考；同时，所获得的信息将对预防和控制大肠杆菌在食品中的流行和传播具有重要的公共卫生意义。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

425份动物性食品 2011年～2013年间从成都市武侯区的超市、菜市场和烧烤店共采集，其中生肉类食品375份（包括生猪肉、生牛肉、生羊肉、生鸡肉和生鸭肉），熟肉类食品50份（包括菜市场零售熟食肉品和超市售卖包装肉品）；EC肉汤、胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）和肠杆菌科细菌生化微量鉴定管 购于杭州微生物试剂有限公司；麦康凯培养基和伊红美蓝培养基 购于青岛海博生物技术有限公司；PCR试剂（Buffer、Mg2＋、dNTP、Taq酶）、Loading Buffer和DNA Marker 购于宝生物工程（大连）有限公司；Greenview

购于bioBRK公司；G-10葡萄糖凝胶 购于biowest公司；其他 均为国产分析纯试剂。

ALS1296 PCR仪、UNIVERSAL HOODⅡ照胶仪购于美国BIO-RAD公司；DYCP-31DN电泳仪 北京市六一仪器厂。

1.2 实验方法

1.2.1 大肠杆菌的分离 采集不同的肉类食品，无菌操作称取样品25 g放入225 mL EC增菌肉汤中，均质5 min。分别稀释至10-6～10-7涂布于麦康凯琼脂平板和伊红美蓝琼脂平板中，在37℃下培养24 h，选取在伊红美蓝培养基上呈紫黑色带金属光泽且在麦康凯培养基上呈红色的菌落，进一步划线分离，直至得到单菌落，用于后续实验。所有菌株经肠杆菌科生理生化鉴定实验，确定为大肠杆菌属。

1.2.2 大肠杆菌毒力基因的检测

1.2.2.1 DNA模板的制备 将分离鉴定得到的菌株经TSB增菌，然后提取样品的总DNA，DNA提取方法参照文献[10]采用微波加热的方式进行提取。

1.2.2.2 扩增引物 在GenBank上搜索大肠杆菌8种毒力基因的序列（eaeA、stx1A、stx2A、hlyA、aggR、est、eltA和bfpA）设计引物，引物设计采用Primer 6.0软件，设计的引物用BLAST进行特异性比对。引物具体信息见表1。引物合成由生工生物工程技术（上海）有限公司完成。

1.2.2.3 PCR检测 PCR扩增反应体系为：25 mmol/L MgCl21.6 μL，10×PCR Buffer（无Mg2＋）2 μL，dNTP Mixture（2.5 mmol/L each）1.2 μL，20 μ mol/L上下游引物各0.5 μL，模板1 μL，TaKaRa Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，用无菌超纯水补足体系至20 μL。PCR扩增条件为：在95℃下预变性5 min；然后进入PCR循环，在95℃下变性40 s，在相应温度下退火50 s，在72℃下延伸40 s，经历35个循环；在72℃下延伸7 min，最后在4℃保存。配制1%的琼脂糖凝胶，取8 μL扩增产物点样，在85 V电压下电泳40 min，经凝胶成像系统观察结果。从检测出的阳性扩增条带中选一个样本，送去测序验证，以保证PCR扩增的准确性。

表1 引物信息Table 1 Primer information

2 结果与讨论

2.1 菌株分离结果

菌株分离结果详见表2，从表2中可以看出，2011年7月～11月间，从170份样品中分离得到大肠杆菌105株，检出率为61.76%；2012年9月～12月间，从159份样品中分离得到大肠杆菌145株，检出率为91.19%；2013年3月～5月间，从96份样品中分离得到大肠杆菌74株，检出率为77.08%。对这三年的结果进行统计，生肉类食品中大肠杆菌检出率为81.07%，熟肉类食品中大肠杆菌检出率为40%。因采样数量和采样时间的不同，生熟肉中大肠杆菌的检出率具有明显的差异性。

周建平[11]从襄樊市大型农贸市场随机抽检的肉类食品中，得出生肉类食品大肠杆菌检出率为生猪肉50%、生牛肉20%，生鸡肉30%，熟肉类大肠杆菌检出率为20%。只帅等[12]对2006～2009年陕西西安市和杨凌示范区市场零售肉及凉拌菜中大肠杆菌进行了调查，零售肉中大肠杆菌阳性样品检出率为87.5%。邹立扣等[13]对2009～2010年四川省各市县的鲜猪肉中大肠杆菌污染情况进行了调查，大肠杆菌检出率为83.33%。史秋梅等[7]对2010年河北省的农贸市场和超市抽检的肉类食品进行了大肠杆菌的检测，生鸡肉和生猪肉的大肠杆菌阳性检出率为35.3%和23.8%。另外，Iyer等[14]从沙特阿拉伯吉达市的大型超市和零售肉店采集60份生肉样，结果发现大肠杆菌的污染率为65%。Momtaz等[8]对印度的生肉类食品进行了大肠杆菌的调查，得出生肉样中大肠杆菌的污染率为29.20%（238/820）。本实验结果表明，生鲜肉类食品中大肠杆菌的检出率为81.07%，与邹立扣和只帅等报道的结果相近，高于周建平、史秋梅和国外等报道的数据；熟肉类食品中大肠杆菌的检出率为40%，高于周建平报道的数据。

表2 肉类样品中大肠杆菌分离结果Table 2 The isolation results of E.coli from meat samples

2.2 分离菌株的毒力基因调查结果

大肠杆菌8种毒力基因的PCR结果统计见表3。总共324株大肠杆菌中，275株未检测到所调查的毒力基因，只有49株菌株中检测到一种及以上的毒力基因。检测的主要流行的毒力基因是eaeA（27株）和aggR（26株），est和bfpA基因未检测出。统计结果表明，携带一个毒力基因的菌株占总菌株的11.42%，携带两个毒力基因的菌株占3.09%，携带三个毒力基因的菌株占0.62%。

表3 分离菌株中毒力基因检出结果Table 3 The detection results of virulence genes of isolated strains

白莉等[6]对中国2005～2007年食源性疾病监测网21个省监测点不同类型食品（主要包括生羊肉、生牛肉、生猪肉、生鸡肉等生肉食品）中分离得到的大肠杆菌O157的毒力基因携带情况进行了分析，结果表明在89株大肠杆菌O157中，有52株（58.43%）携带eaeA基因。Momtaz等[8]对印度生肉类食品进行大肠杆菌的调查指出，牛肉源、绵羊肉源和山羊肉源大肠杆菌中eaeA基因的检出率分别为89.13%、82.85%和75%。在本实验的49株毒力基因阳性菌株中，有27株（55.10%）携带eaeA基因。以上结果说明了肉类食品源大肠杆菌中eaeA基因的流行程度很高。eaeA为紧密素编码基因，介导细菌与肠上皮细胞的紧密黏附，引起“黏附和抹平”损伤，是肠致病性大肠杆菌（EPEC）和肠出血性大肠杆菌（EHEC）的重要定植因子。

产志贺毒素型大肠杆菌（STEC）广泛分布于动物畜体上，人类通过食用动物的肉而被STEC感染，导致胃肠道疾病。STEC的致病性基因stx1与stx2分别编码1型与2型志贺氏毒素，能引起一系列疾病包括水样腹泻、出血性肠炎、血小板减少性紫癜和溶血性尿毒综合征。毕旺来等[15]对武汉市菜场肉类食品中大肠杆菌污染状况的分析，得出猪肉样品中stx1检出率为0.98%（非O157型大肠杆菌）和1.96%（O157型大肠杆菌），stx2检出率为13.70%（非O157型大肠杆菌）和7.80%（O157型大肠杆菌）；牛肉样品中stx1检出率为10.00%（非O157型大肠杆菌）和16.70%（O157型大肠杆菌），stx2检出率为5.00%（非O157型大肠杆菌）和1.70%（O157型大肠杆菌）。Bai等[9]对采自中国两个地理区域的零售生肉进行了STEC的调查，在853份生肉样品中有166份被确定为stx阳性，其中猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉和鸭肉样品检出率分别为4.4%、11.0%、20.6%、0.5%和7.7%。调查结果则表明，成都市武侯区肉类食品中stx1检出率为0.93%（3/324）和stx2检出率为0.31%（1/324），远低于毕旺来和Bai等的报道结果，说明志贺毒素基因stx不是成都市武侯区肉类食品源大肠杆菌的流行基因。

目前未见关于食品源大肠杆菌aggR基因携带情况的调查报道，而本实验的研究结果显示，在49株毒力基因阳性菌株中，有26株（53.06%）携带aggR基因。aggR（转译激活因子基因）是聚集性大肠杆菌（EAEC）的重要致病基因，被建议为典型EAEC菌株的标志基因[16]。EAEC是一类新发现的致泻性大肠杆菌，目前已在世界各发达、发展中国家出现散发或暴发流行。Dallman等[17]从413例胃肠道疾病散发案例中收集了88份粪便样本，发现其中75%的样本被检出aggR基因，预示着EAEC病原的存在。可见，EAEC是一类不容忽视的致泻性大肠杆菌。结果表明了聚集性大肠杆菌是近年来成都市肉类食品中高度流行的致病菌株，应给予足够重视。

2.3 分离菌株的毒力基因随时间变化特征

从毒力基因检出情况随时间变化的结果表4中，可以看出，2011年流行的毒力基因有eaeA、stx1A和hlyA；2012年这三种毒力基因的检出率比2011年明显升高，并且另有stx2A、aggR和eltA三种毒力基因被检出；2013年stx1A和stx2A基因未被检出，但aggR基因的检出率上升很高，接近30%。在这三年中，均未检出est和bfpA基因。从时间分布来看，2011～2013年三年间各种毒力基因的检出率存在显著差异，有一定的毒力变化特征。携带eaeA毒力基因的大肠杆菌在2012年十分流行，携带aggR毒力基因的大肠杆菌在2013年十分突出。另外，2013年分离的大肠杆菌中没有检出志贺毒素stx基因。2011年105株大肠杆菌中仅有7株（6.67%）检出毒力基因，2012年146株大肠杆菌中31株（21.23%）检出毒力基因，2013年74株大肠杆菌中有25株（33.78%）检出毒力基因，说明成都市武侯区肉类食品的安全卫生状况逐年严峻，食用风险程度越来越高。

表4 毒力基因检测情况随时间变化趋势Table 4 The variations of virulence genes with time

3 结论

肉类是微生物滋生的优良场所。由于养殖、屠宰、加工、运输和销售等环节控制不严格，常造成肉类产品中细菌总数增加或出现致病菌，尤其是出现致病性大肠杆菌如O157、O26、O103、O131、O158等血清型[8，18]，引发人类食源性疾病甚至导致死亡。

本调查结果表明，成都市武侯区生肉类中大肠杆菌的检出率高达81.07%，熟肉类中大肠杆菌的检出率为40%左右。在分离的324株大肠杆菌中有49株检测到一种及以上毒力基因；主要流行的毒力基因是eaeA和aggR，未检测到est和bfpA基因。2011年检出毒力基因eaeA、stx1A和hlyA（以eaeA为主），2012年检出毒力基因eaeA、stx1A、hlyA、stx2A，aggR和eltA（以eaeA和aggR为主），2013年检出毒力基因eaeA、hlyA、aggR和eltA（以eaeA和aggR为主）。说明成都市武侯区肉类食品中大肠杆菌的污染水平较高，反映出市场环境卫生和管理较差的现状。因次，应加大力度重视改善肉类食品的生产、储存和分销条件，预防大肠杆菌的污染。

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Investigation of Escherichia coli contamination and virulence genes in meat foods from Wuhou district of Chengdu city

SHI Hui，TANG Jun-ni，CHEN Juan*，LONG Hu，JIANG Mei，WANG Wen-ya
（College of Life Scinece&Technology，Southwest University for Nationalities，Chengdu 610041，China）

The contamination of Escherichia coli in meat foods of Chengdu city and virulent characteristics of isolated strains were investigated in this study，which could lay basis for preventing and controlling of E.coli contamination in food and guaranteeing food safety.Meat samples were collected from the supermarkets and retail markets located in Wuhou district of Chengdu city from 2011 to 2013.These samples were enriched and E.coli strains were isolated and identified.DNA of all the isolated strains were extracted and subjected to PCR detection for eight virulence genes（eaeA，stx1A，stx2A，hlyA，aggR，est，eltA and bfpA）.The detection rate of E.coli for raw meat samples was 81.07%，and the detection rate of E.coli for cooked meat samples was 40%. 49 strains were detected to having more than one virulence genes from 324 isolated E.coli strains.The main prevalent virulence genes were eaeA and aggR，while est and bfpA genes could not be detected.The contamination of E.coli in meat samples was found to be very high.These results would provide significant data for the control and survey of foodborne E.coli in meat samples.

meat；Escherichia coli；contamination；virulence gene

TS201.6

A

1002-0306（2015）22-0209-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.035

2015-05-04

史辉（1990-），男，硕士研究生，研究方向：食品质量与安全，E-mail：823371756@qq.com。

*通讯作者：陈娟（1980-），女，博士，副研究员，研究方向：食品微生物与食品安全，E-mail：chenj1221@126.com。

2014年度教育部回国留学启动项目；2014年度国家民委中青年英才培养计划；西南民族大学研究生创新项目（CX2014SP263）。