林 款，李春美

（华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉430070）

柿子单宁对体外模拟发酵环境中肠道微生物的影响

林 款，李春美*

（华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉430070）

采用体外厌氧发酵法研究了柿子单宁对肠道微生物的影响。将单宁与大鼠肠道微生物共孵育，分别测定0、6、12、24、48 h五个时间点发酵液中六种微生物、短链脂肪酸和pH的变化。结果显示，与空白组相比，添加2 g/L剂量组的柿单宁能有效地促进肠道有益菌（乳杆菌和双歧杆菌）的增殖，抑制有害菌（肠球菌、大肠杆菌、梭菌和拟杆菌）的增殖，增加短链脂肪酸含量，降低发酵液pH。研究结果表明柿子单宁对肠道微生态具有调节作用，可能是其在体内发挥作用的机制之一。

柿子单宁，体外发酵，肠道微生物

多酚化合物是广泛存在于水果、茶、咖啡、葡萄酒和谷物中的一类次级代谢产物[1]，对心脑血管疾病和肠道健康具有调节保护作用[2]。具有能有效消除自由基、促进肠胃消化、降血脂、增强人体免疫力、预防动脉硬化等多种功能[3]。此外，多酚类化合物对金黄色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大肠埃希氏杆菌（Escherichia coli）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）等致病菌均有明显的抑制作用[4]。

众多的研究表明柿单宁在体内外均具有较强的降血脂、抗氧化、抗炎等作用[3-5]。但由于柿子单宁的高度聚合，一般难以被机体吸收利用，其在体内发挥健康作用的途径和机制尚不清楚。越来越多的研究表明人体肠道菌群健康与各种疾病的发生具有密切联系[6]，肠道微生物可利用碳水化合物和蛋白质产生大量的短链脂肪酸，其中双歧杆菌（Bifidobacterium）主要产乙酸和乳酸，乳杆菌（Lactobacillus）产生的乳酸以及拟杆菌（Bacteroides）和丁酸梭菌（Clostridium butyricum）产生的丁酸，能形成微酸性的pH环境，抑制腐败菌的生长，改善肠道微环境，促进机体健康[7]。大量的研究表明，多酚类化合物可通过调节肠道微生物的组成，发挥其健康调节作用。目前研究的比较多的茶多酚、红酒多酚可以通过抑制病原微生物的生长和促进有益菌群的增殖，从而有效地调节肠道菌群的健康[8-10]。一些结构较为简单的天然多酚类化合物通过降解成活性更强的代谢物，从而提高了生物利用率[11]。然而，对于结构复杂的高聚多酚类化合物对肠道健康的调节鲜见研究报道。

体外发酵作为动物实验的补充可以跟踪发酵过程中物质的变化及研究发酵产物的形成过程，弥补了体内发酵不能实现动力学检测的缺点[12]。因此，本研究拟利用体外厌氧发酵方式对分离纯化得到的柿子单宁进行混合发酵培养，通过传统的培养法分析厌氧发酵48 h中有益菌和有害菌的数量变化，利用气相色谱分析产短链脂肪酸的情况以及对应的pH变化，研究其对调节肠道微生态的作用。旨在为探讨高度聚合的多酚在体内发挥药理活性的可能机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

SD雄性大鼠 许可证号：SCXK（鄂）2008-0005，购自湖北省实验动物中心；恭城月柿 购自水果湖水果批发市场；含氮培养基各试剂成分 均购自上海源叶生物公司；MRS琼脂培养基、BBL琼脂培养基、EMB琼脂培养基、肠球菌琼脂培养基、DRCA琼脂培养基、BBE琼脂培养基 均购自青岛海博生物公司；乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸标准品 均购自阿拉丁试剂网。

YQX系列厌氧培养箱 购自上海新苗医疗器械制造有限公司；净化工作台 购自苏州净化设备有限公司；电热恒温培养箱 购自天津市泰斯特仪器公司；压力蒸汽灭菌锅 购自上海三申医疗器械有限公司；气相色谱仪 安捷伦科技有限公司；pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 柿子单宁的提取 采收成熟恭城月柿，利用含有1%盐酸的无水甲醇提取柿子果肉中的单宁，将250 g柿子切碎按料液比为1∶8加入2000 mL无水甲醇，在80℃水浴槽中经过三次冷凝回流合并提取液，35℃条件下旋蒸浓缩去掉溶剂后得到粗提液，置于AB-8大孔树脂吸附40 min，纯水洗至无糖，再用10%的乙醇去掉低分子量酚类化合物，最后用1 L 95%的乙醇洗脱，收集洗脱液旋转浓缩[3]，冷冻干燥后得到聚合度范围在19～47的柿子单宁[13]，置于-20℃冰箱保存。

表1 发酵液配比Table 1 Compounds of each fermentation liquid

1.2.2 体外厌氧发酵 称取柿子单宁样品溶解于高压灭菌后的含氮基础培养基中，培养基组成为：1 L超纯水含有蛋白胨2 g、酵母膏2 g、NaCl 0.1 g、K2HPO40.04 g、MgSO4·7H2O 0.01 g、CaCl2·7H2O 0.01 g、NaHCO32 g、氯化血红素0.05 g、L-半胱氨酸0.5 g、胆汁酸盐0.5 g、吐温80 2 mL、维生素K 110 μL；0.025 g/100 mL刃天青4 mL，pH调至7.0[14]。取SD大鼠盲肠内容物制成粪便样液（10%、pH7.3的PBS）2 mL悬浮于100 mL含有不同浓度柿单宁的底物培养基溶液中，体外发酵液配比见表1。混合均匀后放入厌氧培养箱（10% H2、10%CO2、80%N2）中，37℃厌氧发酵培养。在培养时间为0、6、12、24、48 h时分别取样液，供细菌培养计数和短链脂肪酸含量检测。

1.2.3 生化指标检测

1.2.3.1 发酵液微生物测定 取发酵液1 mL，加入9 mL无菌生理盐水，依次10倍稀释至10-8，采用倾注法进行传统平板培养。选择三个合适稀释度，用于双歧杆菌（Bifidobacterium）、乳杆菌（Lactobacillus）、肠球菌（Enterococci）、大肠杆菌（Escherichia coli）、拟杆菌（Bacteroides）和梭菌（Clostridium bacteria）的培养计数，培养基选用各种菌的选择培养基，培养方法如表2所示。最后以各单宁组菌落数的以10为底的对数与空白组菌落数的以10为底的对数的差值（用N表示）为指标，分析柿单宁对目标菌的影响。

表2 目标菌培养方法Table 2 Methods of target bacteria culture

1.2.3.2 发酵液短链脂肪酸测定 取2 mL发酵液样品分别置于2个离心管中，4℃低温15000 r/min，离心20 min，各吸取上清0.5 mL收集到另一干净离心管中，加入25%的偏磷酸200 μL，涡旋振荡1 min，充分混匀，置于4℃冰箱12 h，再次在15000 r/min、4℃离心20 min，收集上清液到另一干净离心管中，用于气相色谱分析。

气相色谱条件：载气：N2，流速1.5 mL/min；进样口：不分流进样口，进样时间1.2 min，温度250℃；检测器：FID检测器，温度300℃；柱温：100℃保留3 min，以5℃/min速度升至140℃，然后以50℃/min升至200℃，保留3 min；H2流速40 mL/min；空气流速400 mL/min；尾吹气为N2，30 mL/min；色谱柱：DBFFAP 30 m×250 μm×0.25 μm。

1.2.3.3 pH测定 取发酵液样品2 mL于4000 r/min下离心5 min，吸取上清液1 mL，稀释至10 mL，用pH计测上清液pH。

1.2.4 统计分析 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行，实验结果以平均值±标准差表示，各组结果采用LSD显著性差异测验进行单向方差分析，显著水平为0.05，极显著水平为0.01。

2 结果与讨论

2.1 发酵液中微生物的变化

柿子单宁对肠道微生物发酵液中各类菌的影响结果见图1。其中Lab表示乳杆菌（Lactobacillus）、Bif表示双歧杆菌（Bifidobacterium）、Ent表示肠球菌（Enterococci）、E.coli表示大肠杆菌（Escherichia coli）、Bac表示拟杆菌（Bacteroides）、Clo表示梭菌（Clostridium bacteria）。

图1 不同发酵时间柿单宁浓度对不同肠道菌群微生物数量的影响Fig.1 Influence of different concentrations of persimmon tannin on in the bacterial population at different time during the fermentation

与空白组相比，添加2 g/L的单宁在48 h时对乳杆菌和双歧杆菌都有显著（p＜0.05）的促进作用，而对有害的肠球菌、大肠杆菌和梭菌的抑制作用较小，对拟杆菌有显著（p＜0.05）的抑制作用；添加4 g/L的单宁对乳杆菌和双歧杆菌的增殖并没有显著的影响，而对四种有害菌的抑制作用有所增强；添加8 g/L的单宁对人体这两种有益菌具有显著（p＜0.05）的抑制生长作用，在发酵开始阶段最为明显，12 h后对肠球菌、大肠杆菌、梭菌和拟杆菌的抑制作用与比其他组相比更加明显。从整体分析，单宁对乳杆菌和双歧杆菌的促进和抑制作用与添加剂量密切相关，2 g/L的单宁添加量对这两种有益菌的促进效果最好，随着剂量的逐渐增加，当达到8 g/L的单宁添加量时两种有益菌则呈现出明显的负增长趋势。柿子单宁对发酵液中肠球菌、大肠杆菌、梭菌和拟杆菌均有明显的抑制作用，并且随着单宁添加剂量的增大，表现出明显的剂量效应关系。

文献报道石榴苷在有效调节肠道菌群的作用浓度为1 g/L[14]，作用效果优于柿子单宁，而茶多酚的有效作用浓度为2 g/L[15]，与柿子单宁的作用效果相当。有报道植物多酚提取物能促进双歧杆菌和乳酸菌在肠道内的定殖，从而竞争性地抑制病原菌在肠道内的黏附、定殖和繁殖[16-17]。肠道内双歧杆菌和乳酸菌等有益菌数量的增加可以更加有效地减少氨以及前致癌物质的形成[18]，增加有机酸的产生，降低结肠及粪便的pH，抑制病原菌的生长繁殖，从而改善肠道的微环境，促进人体的健康[19]。

表3 柿单宁对发酵过程中四种短链脂肪酸含量的影响Table 3 Effect of persimmon tannin on the concentration of SCFA in fermentation liquids

2.2 发酵液中短链脂肪酸的变化

添加柿子单宁对发酵液中的短链脂肪酸的产量产生了影响，如表3中所示，在发酵12 h后2 g/L单宁处理组乙酸的含量始终维持最高水平，空白组乙酸含量仅次于2 g/L单宁组，而8 g/L单宁处理组乙酸含量最低且变化不大，这是由于肠道中的大部分菌如双歧杆菌、拟杆菌和梭菌对乙酸的产生都有贡献[20]。2 g/L单宁处理组在24～48 h之间双歧杆菌显著增加，而拟杆菌和梭菌减少，导致了乙酸含量的增加，而8 g/L单宁处理组的各种菌都显著减少，导致了乙酸含量维持在一个较低水平。丙酸在发酵6 h时含量最高，然后逐渐下降，24 h后8 g/L单宁处理组丙酸含量下降，空白组和2、4 g/L柿单宁组在24 h后丙酸含量升高，其中2 g/L单宁处理组丙酸含量始终高于其他三组。这是由于丙酸主要是由梭菌产生[20]，2 g/L单宁组对梭菌的抑制作用最小，随柿单宁剂量的增大对梭菌的抑制作用增强，所以丙酸的含量随柿单宁剂量的增大而降低。在发酵24 h后4 g/L单宁处理组正丁酸含量最高，发酵12 h后2 g/L单宁处理组异丁酸含量最高，而8 g/L单处理宁组在发酵12 h后异丁酸含量逐渐降低，其他三组在发酵24 h后正丁酸和异丁酸均有所增大。丁酸对应的产生菌主要是拟杆菌和梭菌[20]，8 g/L单宁处理组对这两种菌抑制作用显著，因此8 g/L单宁组正丁酸和异丁酸含量最低。发酵后期由于营养物质的消耗，肠道微生物开始利用有机酸来生长繁殖，导致有些组在发酵后期短链脂肪酸的含量呈现下降趋势。通过增加肠道中有益菌的生长和抑制有害菌的生长，改变肠道微生物的组成，可以发酵产生更多的短链脂肪酸，从而有效促进肠道微生态的健康[21]。

2.3 发酵液中pH的变化

从图2中可以看出，随着发酵时间的增加，各组发酵液的pH都在明显降低（p＜0.05），发酵24 h时2、4、8 g/L单宁组的pH极显著低于空白组（p＜0.01），24 h后，各组发酵液的pH基本维持不变甚至有微量的增加，其中4、8 g/L单宁组在发酵后期始终维持较低的pH（p＜0.05）。

图2 单宁对发酵液pH的影响Fig.2 Effect of tannin on pH in fermentation liquids

这是由于单宁样品通过肠道微生物的代谢会产生不同类型的酸性物质如短链脂肪酸，从而影响发酵液的pH。随着发酵的进行，肠道菌群在发酵液中产生了各种有机酸，降低了发酵液的pH，因此在发酵过程的各个时段，添加单宁实验组的pH始终低于空白对照组。24 h后由于营养物质的消耗和菌体的生长受到限制，发酵液的pH没有下降反而是有所增加。实验结果中24 h和48 h相比，各类短链脂肪酸都有明显的增加，而对应的发酵液pH没有很明显的降低，分析原因可能是随着发酵时间的增长，发酵液中的营养物质被消耗，肠道微生物的生长利用了一部分的有机酸。

3 结论

本研究结果表明，添加量为2 g/L的柿单宁对乳杆菌和双歧杆菌这两类有益菌增殖有促进作用，高剂量的8 g/L柿单宁对有益菌具有抑制生长的作用，而对有害菌的抑制作用是随着柿子单宁剂量的增加而增大，向发酵液中添加柿单宁改变了肠道微生物的组成。发酵培养液中的多糖和蛋白质类在肠道各种微生物的相互作用下，发酵产生乙酸、丙酸、丁酸短链脂肪酸，随着肠道中各类微生物数量的变化，短链脂肪酸的含量也发生了变化。双歧杆菌的增加导致了乙酸含量的增加，而拟杆菌和梭菌的抑制生长导致在发酵后期8 g/L单宁组中丙酸、丁酸含量最低。因此柿子单宁对于肠道微生态具有一定的健康调节作用，但对肠道微生物的作用机制还有待进一步的研究。

[1]Cueva C，Sanchez-Patan F，Monagas M，et al.In vitro fermentation of grape seed flavan-3-ol fractions by human faecal microbiota：changes in microbial groups and phenolic metabolites [J].FEMS Microbiol Ecol，2013，83（3）：792-805.

[2]Crozier A，Jaganath I B，Clifford M N.Dietary phenolics：chemistry，bioavailability and effects on health[J].Nat Prod Rep，2009，26（8）：1001-1043.

[3]顾海峰，李春美，徐玉娟，等.柿子单宁的制备及其抗氧化活性研究[J].农业工程学报，2007，23（5）：241-245.

[4]田燕，邹波，董小倩，等.不同聚合度柿子单宁的体内外抗氧化作用[J].食品科学，2013，34（13）：54-61.

[5]Zou B，Ge Z Z，Zhang Y，et al.Persimmon Tannin accounts for hypolipidemic effects of persimmon through activating of AMPK and suppressing NF-kappa B activation and inflammatory responses in High-Fat Diet Rats[J].Food&Function，2014，5（7）：1536-1546.

[6]Bialonska D，Kasimsetty Sashi G，Schrader Kevin K，et al. The effect of pomegranate（Punica granatum L.）byproducts and ellagitannins on the growth of human gut bacteria[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2009，57（18）：8344-8349.

[7]胡旭，王涛，王沥，等.肠道共生微生物与健康和疾病[J].中国微生态学杂志，2012，24（12）：1134-1139.

[8]付慧，杨萍，汪秋宽.茶多酚的制备及其抑菌活性的研究[J].食品科技，2012，6（37）：273-276.

[9]Dolara P，Luceri C，De Filippo C，et al.Red wine polyphenols influence carcinogenesis，intestinal microflora，oxidative damage and gene expression profiles of colonic mucosa in F344 rats[J]. Mutat Res，2005，591（1-2）：237-246.

[10]张鑫，马丽萍，张芸，等.茶叶儿茶素对肠道微生态的调节作用[J].食品科学，2013，34（5）：232-237.

[11]李叶，唐浩国，刘建学.黄酮类化合物抑菌作用的研究进展[J].农产品加工，2008（12）：53-55.

[12]任文瑾，吕娇，苏昕峰，等.辣椒素对肠道菌体外发酵的影响[J].食品工业科技，2013（9）：58-61.

[13]Li C M，Leverence R，Trombley J D，et al.High molecularweight persimmon（Diospyros kaki L.）proanthocyanidin：A highly galloylated，a-linked tannin with an unusual flavonol terminal unit，myricetin[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58（16）：9033-9042.

[14]Bialonska D，Ramnani P，Kasimsetty S G，et al.The influence of pomegranate by-product and punicalagins on selected groups of human intestinal microbiota[J].Int J Food Microbiol，2010，140（2-3）：175-182.

[15]蒋玉兰，王彬，毛银，等.茶多酚对保加利亚乳杆菌生长的影响[J].茶食品技术，2012（2）：45-48.

[16]Molan A L，Lila M A，Mawson J，et al.In vitro and in vivo evaluation of the prebiotic activity of water-soluble blueberry extracts[J].World Journal of Microbiology&Biotechnology，2009，25（7）：1243-1249.

[17]Kosmala M，Zdunczyk Z，Kolodziejczyk K，et al.Chemical composition of polyphenols extracted from strawberry pomace and their effect on physiological properties of diets supplemented with different types of dietary fibre in rats[J].Eur J Nutr，2014，3（2）：521-532.

[18]Burns A J，Rowland I R.Anti-carcinogenicity of probiotics and prebiotics[J].Current issues in intestinal microbiology，2000，1（1）：13-24.

[19]Laparra J M，Y Sanz.Interactions of gut microbiota with functional food components and nutraceuticals[J].Pharmacol Res，2010，61（3）：219-225.

[20]左玉.多酚类化合物研究进展[J].粮食与油脂，2013，26（4）：6-10.

[21]Zhou M，Pu C，Xia L，et al.Salecan diet increases short chain fatty acids and enriches beneficial microbiota in the mouse cecum[J].Carbohydr Polym，2014，102：772-779.

Effect of persimmon tannin on gut microflora in vitro fermentation environments

LIN Kuan，LI Chun-mei*
（College of Food Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China）

In the present study，we investigated the effect of persimmon tannin on the intestinal microbial by anaerobic fermentation in vitro，and the changes of microbials，the content of short-chain fatty acids and pH in fermentation broth were measured at 0，6，12，24，48 h，respectively.The results showed that incubating of persimmon tannin（2 g/L）with the intestinal microorganisms promoted proliferation of intestinal bacteria（Lactobacillus and Bifidbacterium）siginificantly，inhibited the proliferation of harmful bacteria（Enterococci，E.coli，Clostridium bacteria and Bacteroides）notabely，and increased short chain fatty acid content and reduced the pH of the fermentation broth as compared with the control group.The results showed that persimmon tannin could regulate the microflora in intestinal tract，which might be one of the mechanisms of persimmon tannin in vivo.

persimmon tannin；fermentation in vitro；gut microflora

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0160-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.025

2015－05－11

林款（1990-），女，硕士研究生，研究方向：柿单宁对肠道微生态的影响，E-mail：1027366570@qq.com。

*通讯作者：李春美（1973-），女，教授，研究方向：天然产物化学，E-mail：lichmyl@mail.hzau.edu.cn。

公益性行业（农业）科研专项（201203047）；武汉市科技攻关计划（20130205010186）。