李瑞龙，陈 杰，王金辉，周彦品，赵长新，*

（1.大连工业大学生物工程学院，辽宁大连116034；2.辽宁省发酵工程重点实验室，辽宁大连116034）

酿酒酵母细胞表面电位与絮凝相关性分析

李瑞龙1，陈 杰2，王金辉1，周彦品1，赵长新2，*

（1.大连工业大学生物工程学院，辽宁大连116034；2.辽宁省发酵工程重点实验室，辽宁大连116034）

为探究酿酒酵母细胞表面所带电荷与絮凝的相关性，以两种液态发酵酵母和两种固态发酵酵母为研究对象，并对液态发酵酵母FFC2144和固态发酵酵母L2Y进行连续传代培养，用zeta电位仪测定其zeta电位，以细胞沉降速率的方法考察酵母的絮凝性。结果显示，离子强度为0时，固态发酵酵母zeta电位（绝对值）均小于30 mV，液态发酵酵母均大于30 mV，培养72 h后的固态发酵酵母絮凝率达到了80.2%，液态发酵酵母絮凝率最大仅为14.4%。在发酵过程中不同酿酒酵母电位无明显变化。随着传代次数的增加酿酒酵母FFC2144 zeta电位无明显变化，絮凝性能却逐渐增强，到第20代时絮凝率达到了94.8%。不同酿酒酵母具有不同的zeta电位，其大小客观地反映出酿酒酵母絮凝性的强弱。酿酒酵母在衰老过程中细胞的絮凝性与zeta电位无关。

酿酒酵母，zeta电位，絮凝，传代培养

酿酒酵母在传代过程中会出现衰老现象，主要表现在发酵能力降低、菌体沉降与衰亡，菌体絮凝增加等方面[1]。酿酒酵母的自絮凝过程是成千上万个细胞形成的一个不可逆的、无性的且依赖钙离子的聚集过程[2-3]。酿酒酵母絮凝一直以来都是国际上研究的热点课题，从生物学的角度来看，引起酵母絮凝的机制纷繁复杂，包括外源性的凝集素、基因调控、含氧量、温度和pH等[4-5]。酿酒酵母絮凝的好坏对于发酵工业是至关重要的，例如在啤酒发酵过程中酵母提前絮凝会导致一系列不良后果，降低生产效率，而在发酵终点酵母的絮凝性能差将不利于产物的分离纯化[6-7]。

酵母细胞在代谢上的变化会通过细胞壁成分的改变体现出来。酿酒酵母悬浊液是一种分散体系，絮凝能否发生取决于两方面的因素：一是由酵母细胞壁带有的净电荷引起的排斥作用，酵母表面的zeta电位恰好能表征这种电荷的大小，当电位的绝对值大于30 mV时，双电层厚度较大，酿酒酵母之间发生弹性碰撞，不利于酵母絮凝，当其小于30 mV时酵母细胞不稳定，增加了絮凝的可能性；二是由细胞壁表面的物质之间发生的吸附架桥作用，这种作用在酿酒酵母的絮凝过程中也起到至关重要的作用[8]。

国外早有利用zeta电位对酿酒酵母进行研究，但大多是与酿酒酵母固定化吸附发酵相关的报道[9-10]，应用zeta电位对酿酒酵母絮凝性能进行分析的报道并不多见[11-12]。固态发酵酵母与液态发酵酵母絮凝性有较大差异，本文试图通过对不同酿酒酵母以及不同衰老程度酵母的zeta电位和絮凝性能进行研究以期找到zeta电位在酿酒酵母絮凝中起到的作用，为酿酒酵母的絮凝研究提供一种新的思路和方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）FFC2146、酿酒酵母FFC2144、酿酒酵母L2Y 大连工业大学菌种保藏所；衡水酵母 河北衡水老白干酿酒（集团）有限公司；葡萄糖 天津市科密欧化学试剂有限公司，分析纯；酵母膏、蛋白胨 北京奥博星生物技术责任有限公司，化学纯；超纯水 电阻率为18 mΩ·cm。

低温冷冻干燥机 美国LABCONCO公司；低速离心机 安徽中佳科学仪器有限公司；Zetasizer Nano ZS90型Zeta电位测定仪 英国Malvern仪器有限公司；85-2型磁力搅拌器 常州国华电器有限公司；JSM-6460LV型扫描电镜 日本JEOL公司；JA2003型电子天平 上海精密科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 酿酒酵母的培养 以斜面保藏的酵母菌种经过二次活化，按照5%（v/v）的接种量接种，培养温度为30℃，摇床转速为160 r/min，培养72 h后转接到新鲜的酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（YPD）中，以第一次培养收获的酵母为第1代酵母菌株，每转接1次增加1代，转接9次后获得第10代酵母细胞，转接19次后获得第20代菌株。

1.2.2 酿酒酵母菌悬液的制备 培养72 h后的酿酒酵母发酵液经4000 r/min离心10 min，收集沉淀，再用超纯水反复洗涤3次离心收集沉淀，将菌体于-80℃冰箱冷冻12 h，真空冷冻干燥（-48℃，4 Pa）得到干燥的酵母细胞，取一定量的菌体用超纯水和不同浓度的NaCl溶液配制成0.2%（w/v）的菌悬液，于磁力搅拌器下搅拌30 s（转速200～222 r/min）后立即进行zeta电位测量。本实验选取第2、10、20代酿酒酵母为典型研究对象。

1.2.3 酿酒酵母zeta电位测量 将制备好的酿酒酵母菌悬液样品注入“U”型弯曲式毛细管样品池中，激光多普勒技术的应用能够测定出酿酒酵母细胞在体系中的电泳迁移速率，从而计算出zeta电位的大小。本实验所有样品均重复测定五次，测定结果取平均值。所有测量均在25℃条件下进行，对于同一个样品zeta电位的测量显示良好的重复性。

为探究离子强度和pH对液态发酵酵母zeta电位的影响，在0～10 mmol/L离子强度梯度，3～10 pH梯度范围内对培养72 h的液态发酵酵母FFC2144与FFC2146进行zeta电位测量。在离子强度为0时，于超纯水中测量第1代四种不同酿酒酵母的zeta电位。分别于0、1、10 mmol/L离子强度条件下对不同代数的液态发酵酿酒酵母FFC2144和固态发酵酿酒酵母L2Y进行zeta电位测量。并测量发酵过程中不同时期四种酿酒酵母的zeta电位。

1.2.4 酿酒酵母絮凝能力的测定 取1 g干燥酿酒酵母菌体，用超纯水稀释至1×106～3×106个/mL，在磁力搅拌器下搅拌2 min使之充分分散到体系中。每管20 mL分装后静置，同时开始计时，每隔3 min从试管中取样4 mL立即检测其在波长600 nm处的吸光值，用该值替代酿酒酵母菌体浓度，用以下公式计算絮凝率：

在离子强度为0的条件下，分别测量四种酿酒酵母的絮凝率随时间的变化曲线。分别于0、1、10 mmol/L离子强度条件下测量不同代数的FFC2144和L2Y的絮凝率。

1.2.5 数据处理 实验数据采用Excel软件求平均值，进行标准差分析，用Origin软件作图。

2 结果与讨论

2.1 pH与离子强度对液态发酵酵母细胞zeta电位的影响

图1 离子强度对FFC2144与FFC2146 zeta电位的影响Fig.1 Effect of ion strength on the zeta potential of FFC2144 and FFC2146

酿酒酵母细胞壁表面附着多种蛋白质和糖蛋白[13]。研究表明，它们大致可以分为三类：其中两类通过共价键与细胞壁相偶联，另外一类则是缺少与细胞壁相连接的糖苷键而附着在细胞壁表面的蛋白质[14-15]。蛋白质上肽链末端带电的氨基酸残基决定了酵母细胞带有静电荷。静电荷的多少决定随着酵母移动的双电层的厚薄程度，双电层的厚度越大zeta电位测定结果越大反之则越小。图1可以看出酿酒酵母FFC2144和FFC2146 zeta电位绝对值随着体系中离子强度的增加而减小，当离子强度小于1 mmol/L时，zeta电位变化明显，离子强度大于1 mmol/L时zeta电位随离子强度变化并不明显，这是由于离子强度的增大压缩了酵母细胞表面的双电层，引起zeta电位降低，而当离子强度继续增大时双电层的压缩变得困难zeta电位的变化随之变得平缓。图2显示酿酒酵母FFC2144、FFC2146 zeta电位均为负值，FFC2144酵母zeta电位的绝对值大于FFC2146，随着pH的增大zeta电位有减小的趋势，但这种变化并不明显。可以看出，酿酒酵母细胞的zeta电位受溶液pH和离子强度大小的影响，pH的变大通过增加溶液中的-OH的浓度改变细胞zeta电位，而离子强度的变化导致的zeta电位变化则是依赖对细胞双电层的压缩和释放来完成的[16]。

图2 pH对FFC2144与FFC2146 zeta电位的影响Fig.2 Effect of pH on the zeta potential of FFC2144 and FFC2146

2.2 不同酿酒酵母的zeta电位以及絮凝能力差异性比较

图3 不同种类酿酒酵母zeta电位差异性比较Fig.3 The difference on zeta potential of different varieties of Saccharomyces cerevisiaes

酿酒酵母FFC2144和FFC2146是液态发酵菌种，而衡水酵母和酿酒酵母L2Y是固态发酵菌种。图3显示了不同酿酒酵母在离子强度为0时的zeta电位差异。从图3中可以看出固态发酵酵母的zeta电位明显高于液态发酵酵母，且液态发酵菌种zeta电位绝对值均大于30 mV，而固态发酵酵母则均低于30 mV。不同液态发酵酵母之间，不同固态发酵酵母之间zeta电位均表现出了差异性。

图4是四种菌的絮凝曲线，可以看出固体发酵酵母的絮凝能力强于液体发酵酵母，培养72 h的L2Y絮凝率达到了80.2%，而FFC2144絮凝率仅为14.4%，这与他们细胞表面的电位差异是一致的。不同酿酒酵母细胞壁成分的差异性很可能决定了酿酒酵母zeta电位以及絮凝能力的不同。从本实验看来，不同酿酒酵母都具有固定的zeta电位，酵母细胞表面所带电荷量越大絮凝性越差。

图4 不同酿酒酵母絮凝曲线Fig.4 The flocculation curves of different varieties of Saccharomyces cerevisiaes

2.3 不同代数酿酒酵母FFC2144和L2Y zeta电位以及絮凝能力差异性分析

图5 不同离子强度下酿酒酵母FFC2144和L2Y zeta电位随传代次数变化曲线Fig.5 The curves of zeta potential of different generation Saccharomyces cerevisiaes FFC2144 and L2Y at different ion strength

以液态发酵酿酒酵母FFC2144和固态发酵酿酒酵母L2Y为研究对象，图5显示了第2～20代酵母在不同离子强度下，两种酵母zeta电位的变化趋势，随着传代次数的增加酵母zeta电位处于波动状态并未出现明显的变化。

图6 不同传代次数酿酒酵母FFC2144和L2Y絮凝曲线Fig.6 The flocculation curves of different generation Saccharomyces cerevisiaes FFC2144 and L2Y

从图6显示的FFC2144酵母絮凝曲线发现不同传代次数的酵母絮凝率出现了较大的差异，第2代酿酒酵母的絮凝能力最弱，而随着传代次数的增加酵母的絮凝能力逐渐增强，第20代时达到94.8%；而酿酒酵母L2Y絮凝性较强，第2代酿酒酵母絮凝率达到80.2%，随着传代次数的增加酵母的絮凝能力有一定增强，但增强幅度不如FFC2144显著，这与姚继斌等[17-18]的实验结果是一致的。随着酿酒酵母FFC2144传代次数的增加细胞壁蛋白总体变化不明显，但会出现明显的差异性蛋白。结合酵母絮凝能力的变化，受传代次数的影响，细胞分泌了能引起酵母絮凝的蛋白，这些蛋白有可能是Flo基因家族表达的絮凝蛋白Flo1p、Flo5p、Flo9p，也有可能是凝集素蛋白Agalp、Aga2p和Sag1p[19-20]。这些蛋白的表达虽然不足以引起酵母细胞zeta电位发生明显的变化，但他们却通过与邻近酵母细胞壁上的甘露糖残基发生“架桥”作用增加其絮凝能力。这种架桥作用能够抵消酵母之间由zeta电位引起的静电排斥力[14]。

2.4 酿酒酵母在发酵过程中的zeta电位分析

图7显示了不同酿酒酵母在发酵过程中的zeta电位变化趋势，随着发酵时间的增加4种酿酒酵母均未发生明显的变化。而W Richard Bowen[16]对3种酿酒酵母的研究表明在发酵过程中zeta电位均随发酵时间的增加而明显降低，原因在于W Richard Bowen测定zeta电位时酿酒酵母处于发酵液中，pH随着发酵时间的延长而降低，离子强度也时刻发生着变化。可能是由于发酵液中离子强度的增大或pH的减小或两者的共同作用使电位减小。本文测量zeta电位时，将酵母置于标准条件下（超纯水制备菌悬液，离子强度为0）。结合不同代数酿酒酵母zeta电位分析，尽管细胞在发酵过程中进行着各种复杂的生命活动，随着代数的增加细胞壁表面也出现了差异性蛋白，对于同种酵母zeta电位却表现出了极强的稳定性。这种稳定性再次说明酿酒酵母具有固定的zeta电位，正是由于这种稳定性以及菌种之间的差异性，使得利用zeta电位的检测来进行菌种的鉴别以及絮凝性能的判定成为可能。

图7 发酵过程中酿酒酵母zeta电位变化曲线Fig.7 The curves on zeta potentials of Saccharomyces cerevisiaes in the process of fermentation

3 结论

对不同酿酒酵母的zeta电位测量以及絮凝能力的测定结果表明，酿酒酵母细胞表面均带有负电荷，不同酿酒酵母带有不同数量的电荷，pH与离子强度能对酵母zeta电位产生影响，离子强度能改变细胞表面的双电层厚度，对酵母zeta电位有一定影响。固态发酵酵母zeta电位明显大于液态发酵酵母的zeta电位，且与各自的絮凝能力表现出一致性：zeta电位绝对值越小菌体絮凝能力越强，zeta电位反映出了酵母絮凝性能的强弱。不同传代次数及发酵过程中zeta电位实验表明，酵母在传代培养以及发酵过程中zeta电位均不发生明显变化，表现出极强的稳定性，说明zeta电位对于同一酿酒酵母而言是固定不变的；而不同代数酿酒酵母絮凝能力却随着代数的增加而增强，在酿酒酵母衰老过程中其絮凝性能与细胞表面电位无关。出现这种现象的原因是酿酒酵母随着代数的增加，细胞壁表面分泌了一些能够导致絮凝的蛋白，这些蛋白通过“架桥”作用使酵母聚集[18]。

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Correlation between surface potential and flocculation of Saccharomyces cerevisiae

LI Rui-long1，CHEN Jie2，WANG Jin-hui1，ZHOU Yan-pin1，ZHAO Chang-xin2，*
（1.School of Biological Engineering，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China；2.Key Laboratory of Fermentation Engineering in Liaoning Province，Dalian Polytechnic University，Dalian 116034，China）

Two liquid fermentating yeasts and two solid fermentating yeasts were prepared for the research to study the relevance between surface potential and flocculation of Saccharomyces cerevisiae.Saccharomyces cerevisiae FFC144 and L2Y were inoculated from generation to generation，zeta potentials of different breed yeasts and different generation were measured using a standard instrument，yeast flocculability was measured by the method of calculating cells sedimentation rate.Results showed that，when ionic strength was 0，zeta potential of solid fermentating yeasts were less than 30 mV（absolute value），while the liquid fermentating yeasts in all cases were more than 30 mV，the flocculation rate of the solid fermentating yeasts which were cultivated 72 h reached 80.2%，and the liquid fermentating yeasts possessed a maximum value of only 14.4%.There was no significant alteration of the zeta potential in the process of fermentation，and so was the Saccharomyces cerevisiae FFC2144 in the process of subculturing.Flocculability of the Saccharomyces cerevisiae FFC2144 was enhanced gradually which reached 94.8%in the 20th generation.Different Saccharomyces cerevisiae possessed different zeta potential，the magnitude of which objectively reflected the strength of flocculability.In the process of yeast aging，flocculation had nothing to do with the surface potential of cells.

Saccharomyces cerevisiae；zeta potential；flocculation；subculture

TS201.1

A

1002-0306（2015）22-0100-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.22.012

2015－03－19

李瑞龙（1989-），男，硕士，研究方向：发酵工程，E-mail：pennylrl@163.com。

*通讯作者：赵长新（1955-），男，大学本科，教授，研究方向：发酵工程，E-mail：zhaocx@dlpu.edu.cn。