马莉岷，战伟超，于 江，林 剑，徐世艾*

（1.烟台大学 化工制造省级重点实验室，山东 烟台 264005；2.山东鲁花生物科技有限公司，山东 烟台 264005）

琥珀酸钠具有明显的海鲜贝类滋味，广泛用于方便面海鲜汤料、肉制品、酱油、海鲜类产品等食品及其加工领域[1]。琥珀酸钠作为调味品其主要特征：具有贝类风味，是提高食品美味的一种新型呈味物质；可与其他调味品以一定的比例混合使用可起到协同增效的作用；琥珀酸钠在调味的同时，还能缓和其他调味品的刺激（如盐味）；由于琥珀酸钠具有良好的热稳定性，故可广泛的使用在需要热处理的食品加工中；琥珀酸钠渗透性强，增强了其调味效果，同时它又是不挥发性有机酸，具有一定的防腐作用。综上所述，琥珀酸钠作为新型的增鲜剂将具有良好的发展趋势[2]。

用于酱油生产的AS3.024或其诱变菌株在发酵过程中只能产生微量的琥珀酸。而目前发酵法生产食用级琥珀酸还未实现规模化和产业化，生产成本限制了其在酱油中的使用，最重要的是直接在酱油中添加琥珀酸也难以被消费者接受[3-5]。因此，本研究致力于在发酵过程中提高酱油中琥珀酸的含量，增加其鲜味。

近年来，国内外相关研究主要集中于琥珀酸菌种的选育和发酵培养条件优化等方面[6-7]。相比于菌种的诱变选育和丁二酸的分离纯化所做的工作，有关于琥珀酸产生菌在多菌种酿造酱油中的应用研究鲜见报道[8-9]，针对丁二酸固体发酵动力学的研究也很少，刘晓艳等[10-11]从酿酒大曲中成功分离筛选出一株琥珀酸产生菌，该菌具有淀粉、蛋白水解能力，系一株真菌门（Fungi）、藻菌纲（Phycomycetes）、毛霉目（Mucorales）、毛霉科（Mucoraceae）、毛霉属（Mucor）、总状枝毛霉组（Racemousus）中的总状枝毛霉（M.racemosusFresenius），将其命名为SH-20。SH-20固体制曲所得成曲按照一定比例与AS3.024成曲混合后，采用高盐稀态酿造工艺，得到的成品中琥珀酸含量明显提高，含量达0.48 g/100 mL。为了进一步探究其最适发酵条件，最终实现工业化规模生产。因此，在对琥珀酸产生菌SH-20发酵培养基和发酵条件研究的基础上，对该菌株的固体发酵动力学进行了初步研究，建立了琥珀酸产生菌SH-20菌体生长、产物形成和底物消耗动力学模型。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

琥珀酸产生菌SH-20：烟台大学生物工程实验室保藏。

斜面培养基采用马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）培养基：马铃薯200 g、琼脂15～20 g、葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH自然。

固体制曲培养基：豆粕12 g，润水20 min后蒸料，再加入小麦粉8 g，灭菌20 min，pH自然。

1.2 仪器与设备

LRH-250生化培养箱、PHG-9245A电热恒温干燥箱：上海一恒科技有限公司；7200紫外可见分光光度计：上海菁华科技仪器有限公司；2487高效液相色谱仪：美国Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 培养方法

菌悬液的制备：刮取斜面培养基中的孢子于生理盐水中，振荡5 min，用血球计数板测定孢子浓度。

培养基的制备：按1.1方法配制培养基。

发酵：待培养基冷却后吸取菌悬液接种于培养基中，使含水量为62%的固体培养基中接种量为4.4×105个/g，30 ℃培养箱中培养72 h。

1.3.2 分析方法

（1）底物干质量的测定

取不同发酵时间的培养物，将固体曲于60 ℃烘干至恒质量，底物干质量计算公式如下：

（2）菌体量的测定

采用核酸测定法[12-13]。

（3）琥珀酸含量的测定

样品处理：称取5 g烘干后的固体曲、粉碎、60 ℃浸提4 h、5 000 r/min离心20 min，取上清液经0.45 μm滤膜过滤由HPLC测定琥珀酸含量。

色谱条件：色谱柱为YMC-pack ODS-A（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为V（甲醇）∶V（0.02 mol/L KH2PO4）=7∶93，pH 2.5流动相流速0.5 mL/min，进样量为20 μL，检测波长214 nm。

1.3.3 数据处理方法

应用Origin8.0软件处理实验数据和模型，拟合出所有模型参数，建立发酵动力学数学模型。

2 结果与分析

2.1 琥珀酸产生菌固态发酵过程中主要参数的变化情况

对琥珀酸产生菌固体发酵产丁二酸过程中主要参数底物消耗、菌体生长和琥珀酸合成的变化情况进行了测定，结果见图1。从图1可以看出，发酵过程中，琥珀酸的合成与菌体生长同步，增长趋势基本一致。而底物消耗呈先快后缓的趋势。在经过很短的延迟期后，菌体进入对数生长期，同时伴随琥珀酸的生成，底物消耗用于菌体生长和琥珀酸产生。到72 h左右，进入生长稳定期，底物消耗减缓，产物浓度变化也小，发酵周期可控制在72 h左右。

图1 琥珀酸产生菌固体发酵过程Fig.1 Solid-state fermentation process of succinic acid producing strain

2.2 固态发酵动力学模型的建立

2.2.1 菌体生长动力学模型

Monod模型作为描述菌体生长最简单且有效的模型，是典型的决定论均相非结构模型。此方程基于单一生长限制性底物，其他营养成分不影响微生物生长；假设菌体得率为常数，且没有动态滞后的情况，这两种假设不符合琥珀酸发酵的特征，采用Monod方程有偏差[14]。

而Verhulst-Pearl提出的Logistic方程是一个典型的S型曲线，能反映菌体浓度增加对自身生长的抑制作用，能较好的拟合发酵过程的菌体生长规律[15]。

菌体生长可用Logistic模型来描述，即：

式中：X为菌体浓度，mg/g；μmax为最大比生长速率，h-1；Xmax为最大菌体浓度，mg/g。

2.2.2 产物形成动力学模型

微生物的产物形成过程非常复杂，GADEN E L[16]将产物合成与菌体生长及底物消耗相关联，定性的将发酵过程分为3种类型：①生长偶联型：只是在菌体生长时才有产物生成；②部分偶联型：在菌体生长时有部分产物形成，大部分产物是在菌体处于生长稳定期形成的；③非偶联型：细胞存在，产物就会生成。Luedeking-Piret方程对一般发酵过程原则上都适用。因此选用式（2）描述产物琥珀酸的动力学模型。

式中：α为产物合成系数；β为非生长偶联系数；p为琥珀酸含量，mg/g。

2.2.3 底物消耗动力学

底物的消耗用以菌体维持、菌体生长和产物消耗，常用的底物消耗动力学模型基于底物消耗的物料恒算建立的方程式，常用模型为：

式中：S为底物减质量，%；Ke为维持系数；yX/S为菌体得率系数。

2.3 动力学模型的求解和拟合

2.3.1 菌体生长动力学模型的求解

对式（1）进行积分可得：

用Origin8.0软件按上式（4）进行非线性曲线拟合，得到菌体浓度X随时间变化的函数为：

根据式（5）可计算出不同时间的菌体浓度，该方程与发酵过程中的实验数据较好的拟合，其平均拟合误差为0.44%，由图2可以看出，计算值与实验值基本吻合。可计算出其最大菌体浓度Xmax=33.382 mg/g，菌体的初始浓度X0=1.695 mg/g，最大比生长速率μmax=0.067 h-1。

图2 SH-20发酵过程中菌体浓度随时间变化曲线Fig.2 Changing curves of bacteria concentration during strain SH-20 fermentation

2.3.2 产物生产动力学模型的求解

将式（1）带入式（2）并积分：

将μmax=0.067，X0=1.695 mg/g，Xmax=33.382 mg/g 代入产物生成动力学模型，整理成：

通过Origin8.0软件对发酵过程中琥珀酸合成的实验数据进行处理，可求得α=1.736，β=-0.001 1，因此琥珀酸合成动力学表达式为：

该方程与实验所得数据能较好地拟合，结果如图3所示。

图3 SH-20发酵过程中琥珀酸含量随时间变化曲线Fig.3 Changing curves of succinate concentration during strain SH-20 fermentation

2.3.3 底物消耗动力学模型的求解

为简化模型，菌体呼吸等维持代谢消耗归结在长菌消耗之内。琥珀酸产生菌的基质消耗大体可分为长菌消耗和生成琥珀酸产物消耗两部分。底物消耗的动力学模型简化为：

其中yX/S为细胞收率系数；yp/S为纤维素产率系数，令1/yX/S=A，令1/yp/S=B。

将式（1）和式（2）带入式（9）积分得：

通过Origin8.0软件对其进行非线性回归拟合得到：1/yX/S=-0.002 6，1/yp/S=-0.389 6。

因此底物消耗动力学方程为：

该方程与实验所得数据能较好地拟合，结果如图4所示。

图4 SH-20发酵过程中底物随时间变化曲线Fig.4 Changing curves of substrate consumption during strain SH-20 fermentation

3 结论

采用Logisstic方程、Luedeking-Piret方程和类似Luedeking-Piret方程，结合琥珀酸产生菌SH-20发酵特征分析，建立了SH-20固体发酵过程中菌体生长、产物合成以及底物消耗随时间变化的发酵动力学模型，将模型预测值与实验值进行比较，结果表明所建立的模型能就较好预测实际发酵过程，对于优化发酵工艺，进一步放大具有重要的指导作用。

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