杨永生，黄 婷，刘良忠*，贾维宝，曹宇翔，陈 琳

（武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北武汉 430023）

流行病学资料表明，慢性肾病（chronic kidney disease，CKD）已经成为一个威胁全世界公众健康的主要疾病[1]。据国际肾脏病学会预测，目前慢性肾病患者约占全人类总人口的10%[2]，慢性肾病已经成为了一个威胁全世界公众健康的主要疾病。大量的试验证明：限制饮食中的蛋白摄入，给予CKD患者低蛋白膳食，可以延缓或防止慢性肾衰竭。FOUQUE D等[3]研究发现，低蛋白饮食可减缓非糖尿病患者肾衰竭的速度；MINO M等[4]研究显示，限制蛋白质摄入量能有效地防止幼鼠肾功能衰竭；徐玉霞[5]研究发现，酮酸辅以低蛋白饮食能有效延缓慢性肾功能衰竭的进展，降低甲状旁腺素。

人体中的磷主要由肾脏排泄，CKD患者由于肾脏损伤，体内极易出现磷储留，引发高磷血症。高磷血症会引起肾性骨病、继发性甲旁亢，并且导致血管和软组织的钙化[6]，是影响CKD的重要危险因素。在针对高磷血症的治疗中，限制饮食中磷的摄入被视为首要的治疗方法[7]。

大米是人类的主食之一，在我国以大米为主食的人口约占总人口的2/3，但是稻米中的蛋白质属于非优质蛋白。因此，开发低蛋白、低磷的大米制品对CKD患者具有重要意义。目前，除去大米中蛋白质的方法主要有：碱浸法、表面活性剂法、超声波法、酶法[8]。超声波法由于能耗高，不适于作为独立提取方法，一般用于其他提取方法的辅助[9]。在对比碱浸法、表面活性剂法、酶法分离大米蛋白，制备大米淀粉的研究中发现，三种方法对大米蛋白的分离能力相近，但是酶法制得的大米淀粉，其颗粒的破损率小、粒径小、形状规整[10-11]。有研究表明，谷物中的磷大部分存在于蛋白质中，因此，选择一种合适的方法在脱除谷物中蛋白的同时，降低磷含量显得至关重要。

本试验以市售大米为原料，进行碱性蛋白酶水解，分析各种因素对磷残留率和蛋白残留率的影响，旨在找出最适的水解途经，制备出低蛋白含量且低磷含量的大米粉，为后期功能性食品的开发提供原料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大米：安徽白湖大米有限公司；碱性蛋白酶：安琪酵母股份有限公司；氢氧化钠（分析纯）：天津市百世化工有限公司；硫酸（分析纯）：广东光华化学厂有限公司；高氯酸（分析纯）：天津市鑫源化工有限公司；硝酸（分析纯）：开封东大化工有限公司；钼酸铵（分析纯）：天津市化学试剂四厂；对苯二酚（分析纯）：上海山浦化工有限公司；亚硫酸钠（分析纯）：天津市凯通化学试剂有限公司；磷酸二氢钾（优级纯）：天津市化学试剂研究所。

1.2 仪器与设备

85-2 型数显恒温磁力搅拌器：金华市瑞华试验仪器厂；HH-2 数显恒温水浴锅：国华电器有限公司；Various EL元素分析仪：德国Elementar公司；电子天平（精度0.000 1 g）：瑞典梅特勒公司；722型分光光度计：龙尼柯（上海）仪器有限公司；DELTA 320 pH计：梅特勒-托利多（上海）仪器有限公司；SpS2001F电子天平：梅特勒-托利多（常州）称重设备系统有限公司；AR2140电子分析天平：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；LD5-10低速离心机：北京医用离心机厂；DS-1高速组织捣碎机：上海标本模型厂。

1.3 试验方法

1.3.1 低蛋白低磷大米粉的制备工艺

碎米→粉碎→加水浸泡→烘干（过100目筛）→酶解→离心→水洗→沉淀→干燥→粉碎→成品

1.3.2 操作要点

将大米粉碎后用1∶4（g∶mL）料液比加水在常温条件下浸泡24 h，用鼓风干燥箱50 ℃条件下干燥8 h，过100目筛制得大米粉。

取20 g大米粉，加入一定料液比的蒸馏水，再加入碱性蛋白酶，调节pH值，于一定温度水解数小时。之后，将水解液离心（4 000 r/min、15 min），去上清液并刮掉沉淀表面暗灰色物质，用蒸馏水清洗沉淀两遍，再重复离心1次，去上清液并刮掉沉淀表面暗灰色物质，然后用3倍于淀粉沉淀的蒸馏水将其溶解，调节pH值为7，再离心，弃上清液刮掉暗灰色上层，将剩余的沉淀放于鼓风干燥箱中于50 ℃干燥12 h，过100目筛即得低蛋白低磷大米粉。

1.3.3 检测方法

水分的测定：常压干燥法[12]；灰分的测定：灰化法[13]；脂肪的测定：采用GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的测定》中的索氏抽提法；淀粉的测定：采用GB/T 5009.9—2008《食品中淀粉的测定》中的酶水解法；蛋白质的测定：元素分析法[14]；磷的测定：分光光度法[15]。

1.3.4 单因素试验

（1）加酶量对水解效果的影响：取大米粉5份，在料液比为1∶6（g∶mL），温度为50 ℃，pH值为9.0的条件下，分别加入底物质量0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%的碱性蛋白酶，水解5 h，离心、干燥后，取样测定其蛋白质和磷含量，确定最佳的加酶量。

（2）时间对水解效果的影响：取大米粉5份，在料液比为1∶6（g∶mL），温度为50 ℃，pH值为9.0，碱性蛋白酶为底物质量1.0%的条件下，分别水解3 h、5 h、7 h、9 h、11 h，离心、干燥后，取样测定其蛋白质和磷含量，确定最佳的水解时间。

（3）温度对水解效果的影响：取大米粉5份，在料液比为1∶6（g∶mL），pH值为9.0，碱性蛋白酶为底物质量1.0%的条件下，分别在30 ℃、40 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃水解5 h，离心、干燥后，取样测定其蛋白质和磷含量，确定最佳的水解温度。

（4）pH对水解效果的影响：取大米粉5份，在料液比为1∶6（g∶mL），温度为50 ℃，碱性蛋白酶为底物质量1.0%的条件下，分别调节溶液pH值为8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，水解5 h，离心、干燥后，取样测定其蛋白质和磷含量，确定最佳的pH值。

（5）料液比对水解效果的影响：取大米粉5份，分别按料液比为1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10（g∶mL）溶解在水中，在温度为50 ℃，pH值为9.0，碱性蛋白酶为底物质量1.0%的条件下，水解5 h，离心、干燥后，取样测定其蛋白质和磷含量，确定最佳的料液比。

1.3.5 大米粉酶解工艺优化试验

在单因素试验的基础上，选取温度、加酶量、时间和pH值4个因素为试验因素，以大米粉中的蛋白质残留率（Y1）和磷残留率（Y2）为指标，进行4因素3水平正交试验，确定低蛋白低磷大米粉的最优制备工艺。正交试验设计见表1。

表1 酶解条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment for hydrolysis conditions optimization

1.3.6 数据处理

采用SPSS软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 磷含量的标准曲线

磷含量的标准曲线见图1。由图1可知，标准曲线为y=0.107 3x-0.000 4，R2=0.999 2，曲线相关性良好。

图1 磷标准曲线Fig.1 Standard curve of phosphorus

2.2 大米原料基本成分

对大米原料进行成分分析，其结果见表2。

表2 大米基本成分Table 2 Basic composition of ric e

2.3 单因素试验结果及分析

2.3.1 加酶量对蛋白残留率、磷残留率的影响

图2 加酶量对蛋白残留率(A)和磷残留率(B)的影响Fig.2 Effect of enzyme addition on protein residual rate (A)and phosphorus residual rate (B)

由图2A可知，随着酶添加量的增加，蛋白的残留率呈先下降后平缓的趋势。在加酶量较少时，底物中蛋白质不能被酶制剂充分水解，蛋白质残留率较高；随着酶制剂的不断增加，底物中蛋白质被逐步水解；在加酶量达到1.2%时，底物中蛋白质与酶制剂的结合达到了相对饱和，底物中蛋白质被充分水解而释放出来，蛋白质残留率达到较低水平，之后无明显变化。由图2B可知，加酶量对大米粉中磷残留率的影响趋势与对蛋白质残留率的影响趋势基本一致。综合考虑，将最适的加酶量定为1.2%。

图3 时间对蛋白残留率(A)和磷残留率(B)的影响Fig.3 Effect of time on protein residual rate (A) and phosphorus residual rate (B)

2.3.2 时间对大米粉蛋白残留率、磷残留率的影响

由图3A可知，随着时间的增加，蛋白的残留率不断下降，当时间达到7 h之后，蛋白残留率下降趋于平缓。在试验初期，酶制剂与底物中大量的蛋白结合，水解速度迅速，随着时间的延长，底物中的蛋白量变少，水解速度变低，蛋白残留率下降趋势变缓。由图3B可知，随着时间的延长，磷的残留率呈不断下降趋势，在水解时间为7～9 h时，磷的残留率变化不大。并且时间过长会严重增加成本。所以综合考虑，将酶解的最佳时间定为7 h。

2.3.3 温度对大米粉蛋白残留率、磷残留率的影响

由图4A可知，随着温度的增加，蛋白的残留率呈先下降后上升趋势，当温度达到55 ℃时，蛋白的残留率达到最低值0.51%。由此可知，酶制剂的最适温度范围在50～60 ℃之间，在这个最适范围之外，酶制剂会出现变性失活，进而导致酶解速度变慢，蛋白残留率偏大。由图4B可知，随着温度的升高，磷的残留率呈下降趋势，当温度＞55 ℃之后，下降趋势变缓。由于温度过高会导致部分淀粉糊化，使得淀粉颗粒破裂，所制产品品质变差。所以综合考虑，将酶解的最适温度定为55 ℃。

图4 温度对蛋白残留率(A)和磷残留率(B)的影响Fig.4 Effect of temperature on protein residual rate (A) and phosphorus residual rate (B)

2.3.4 pH对大米粉蛋白残留率、磷残留率的影响

图5 pH对蛋白残留率(A)和磷残留率(B)的影响Fig.5 Effect of pH on protein residual rate (A) and phosphorus residual rate (B)

由图5A可知，随着pH值的增加，蛋白的残留率不断下降，当pH值达到10.0以后，下降趋势变缓。由此可知，在pH值为10.0～12.0时，酶制剂达到了相对的最高活性。但是，由于pH值＞10.0之后，会大大降低淀粉的糊化温度，使部分淀粉在低温下发生糊化，从而使淀粉颗粒破裂，增大破损淀粉的量，对所制产品品质有很大影响。所以，最适pH值不宜超过10.0。从图5B可知，随着pH的增加，磷的残留率不断下降，说明pH值越大越有利于磷的溶出，考虑到产品的综合品质，将水解的最佳pH值定为10.0。

2.3.5 料液比对大米粉蛋白残留率、磷残留率的影响

图6 料液比对蛋白残留率(A)和磷残留率(B)的影响Fig.6 Effect of solid to liquid ratio on protein residual rate (A)and phosphorus residual rate (B)

由图6A可知，随着料液比的增加，蛋白的残留率呈先下降后上升趋势。当料液比为1∶6（g∶mL）时，其酶解效果最好，蛋白的残留率达到最小值0.832%。料液比过小，会致使溶液的浓度过大，影响酶制剂与底物蛋白间传质的进行，进而使得水解速度过缓；料液比过大，会降低溶液浓度，使得酶的浓度变小，不利于底物中蛋白与酶制剂的结合，进而导致水解速度变慢。由图6B可知，料液比对大米粉中磷残留率的影响趋势与对蛋白质残留率的影响趋势基本一致。综合考虑，将水解的最佳料液比定为1∶6（g∶mL）。

2.4 碱性蛋白酶酶解条件优化正交试验结果与分析

根据以上单因素试验结果，采用4因素3水平正交试验对影响大米中蛋白残留量和磷残留量的主要因素进行分析，并优化出较佳的工艺条件。正交试验的试验结果与分析见表3，方差分析见表4和表5。

由表3可知，以蛋白残留率为考察指标时，各影响因素大小依次为温度＞加酶量＞pH值＞时间，最优方案为温度55 ℃，加酶量1.2%，时间9 h，pH值10.0；以磷残留率为考察指标时，各影响因素大小依次为pH值＞温度＞加酶量＞时间，最优方案为pH值10.0，温度60 ℃，加酶量1.2%，时间9 h。由于蛋白酶在55 ℃和60 ℃时的活性均处于较高水平，但温度过高会加速淀粉的糊化，破坏淀粉颗粒的完整性，不利于最终产品的综合品质。因此综合考虑，低蛋白低磷大米粉的最佳酶解条件确定为A2B2C3D3，即温度为55 ℃，加酶量为1.2%，时间为9 h，pH值为10.0，料液比为1∶6（g∶mL）。经试验验证得出，在此条件下，制得的大米粉中蛋白残留率为0.32%（脱蛋白率96.05%），磷残留率为45.65 mg/100 g（脱磷率70.16%）。由表4可知，各因素对蛋白残留率均有显著影响，其中温度影响最大，4个因素各水平间均有显著性差异。由表5可知，4个因素中除时间外，pH值、温度、加酶量均对磷残留率有显著性影响，其中pH值影响最大，3个因素各水平间均有显著性差异。

表3 酶解条件优化正交试验结果与分析Table 3 Results and analysis of orthogonal experiment for hydrolysis conditions optimization

表4 蛋白残留率正交试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of orthogonal experiment results for phosphorus residual rate optimization

表5 磷残留率正交试验结果方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal experiment results for phosphorus residual rate optimization

3 结论

以大米为原料，采用碱性蛋白酶水解大米粉，在脱去蛋白质的同时，也可以使大米粉中磷的含量减少。在除去大米中磷含量的试验中，溶液的温度、pH值对磷的残留率影响较大，适当的调节溶液温度、pH值，有利于减少大米中磷的含量。制备低蛋白低磷大米粉的最佳水解工艺为温度55 ℃，加酶量1.2%，时间9 h，pH值10.0，料液比1∶6（g∶mL），在此条件下，得到的大米粉中蛋白残留率为0.32%，磷残留率为45.65 mg/100 g。

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