李学伟，朱新贵*，梁姚顺，曾小波

（李锦记（新会）食品有限公司，广东 江门 529156）

大豆是酿造酱油的主要原料，包括全大豆和脱脂大豆。全大豆和脱脂大豆的主要成分差异是有机溶剂浸出的油脂类物质，主要包括油脂、磷脂、游离脂肪酸、生育酚（维生素E）、植物固醇和微量碳氢化合物等油脂成分，其中油脂、磷脂和游离脂肪酸占到了大豆总脂溶性物质的96.8%以上[1-2]。全大豆的相对价格较高，而脱脂大豆作为油脂工业的副产物，价格相对便宜。但使用脱脂大豆制作的酱油风味通常明显比使用全大豆酿制的酱油差，风味物质如醇类、酯类和杂环酮类等物质种类和含量都相对较少。目前世界酱油年产量已达800万t，其中中国约600万t，而多数优质酱油和出口酱油仍在使用全大豆[3-6]。

中国传统酱油酿造周期长，3～6个月不等，根据脂质一般氧化分解规律，含不饱和脂肪酸的大豆脂质在晒露发酵过程中受氧、光照、高温、金属离子和脂肪酶等作用，极易形成氢过氧化物，随后降解成短链脂肪酸、单不饱和脂肪酸、多不饱和脂肪酸、烷烃和烯烃等化合物。并可进一步氧化或环化成醛、酮、杂环化合物、内酯以及烷基呋喃等[7-8]，虽然这些成分可能含量很低，但由于口味阈值低，是不可忽视的风味成分[9]。另外，脂质降解生成的各种脂肪酸与酱醪中的乙醇重新生成小分子酯类，此酯类化合物具有芳香香气[10-11]。长期以来，大豆油脂类成分在酱油酿造过程中对酱油品质的影响只是在感官差异分析上[12-13]，缺乏在机理上探究油脂类成分代谢与酱油风味物质的形成关系。本研究分别以全大豆和脱脂大豆为主要原料进行酿造酱油试验，对比分析其酱油品质的差异；并利用GC-MS对酱油挥发性成分进行分析，阐明2种酱油挥发性香气物质的差异，为研究大豆油脂类成分在酱油酿造过程中的变化和对酱油风味的影响提供初步分析数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

全大豆、脱脂大豆、米曲霉（Aspergillus oryzae）：由李锦记（新会）食品有限公司提供。

氢氧化钠、甲醛、盐酸、葡萄糖、重铬酸钾等：中国医药（集团）上海化学试剂公司。

1.2 仪器与设备

UV1100紫外可见光分光光度计：北京莱伯泰科仪器有限公司；PAL-α Brix计：日本ATAGO公司；HH-4数显恒温水浴锅：常州普天仪器制造有限公司；794全自动滴定仪：瑞士万通（中国）有限公司；TRACE GC-MS-2000气相色谱-质谱联用仪：美国Thermo Finnigan公司；HP-INNOWAX毛细管柱：上海笛柏实验设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 全大豆和脱脂大豆酿造酱油的制备

根据大豆和脱脂大豆的总氮含量，调节各酱油酿造原料的总氮，使原料中的总氮含量保持一致。采用高盐稀态酿造酱油工艺，原料制作大曲后进行天然晒露酿造，酱油酿造发酵90 d。

1.3.2 酱油常规指标测定

氨基酸态氮（amino acid nitrogen，AN）、总氮、总酸、氯化钠、pH值、波长530 nm条件下的色泽A530nm（稀释10倍）和感官评定（每项最高分为10分）均按GB 18186—2000《酿造酱油》的方法测定；还原糖按GB/T 5009.7—2008《食品中还原糖的测定》的方法测定；固形物采用Brix计测定。

1.3.3 酱油挥发性成分测定

固相微萃取：取样品30 mL密封于100 mL顶空样品瓶，置于40 ℃水浴中电磁搅拌，固相微萃取纤维顶空萃取40 min，250 ℃解吸3 min后进样。

气相色谱分析条件：HP-INNOWAX毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；载气He，流速1.0 mL/min；程序升温，起始温度45 ℃保持5 min，升温速率5 ℃/min，温度至200 ℃，保持15min，升温速度10 ℃/min，最终温度220℃，保持5 min；汽化室温度220 ℃，进样量0.8 μL。

质谱分析条件：电离离子源（electron ionization，EI），电子能量70 eV，发射电流200 μA，电子倍增器电压350 V，离子源温度200 ℃，质量扫描范围35～335 amu。

数据处理：试验数据处理由Xcalibur软件完成，在NIST谱库（107 000个化合物的数据）和Wiley谱库（320 000个化合物的数据，Version6.0）对未知化合物进行检索并计算匹配度，只有当正反匹配度均＞800（最大值为1 000）时才能确证该物质。

2 结果与分析

2.1 全大豆酿造酱油和脱脂大豆酿造酱油常规指标测定分析

酱油天然晒露酿造90 d后，测定酱油的常规指标。全大豆酿造酱油和脱脂大豆酿造酱油的常规指标分析见表1。

表1 全大豆酿造酱油和脱脂大豆酿造酱油常规指标比较Table 1 Comparison of physiochemical properties of soy sauce produced from whole soybeans and defatted soybeans

由表1可知，全大豆酿造酱油和脱脂大豆酿造酱油的氨基酸态氮、总氮、pH值、NaCl、可溶性固形物含量之间没有显著差异（P＞0.05），而总酸、色泽A530nm和还原糖之间存在显著差异（P＜0.05）。由于全大豆和脱脂大豆酿造酱油的原料总氮和酿造工艺一致，所以氨基酸态氮、总氮、Na-Cl和可溶性固形物含量没有明显差异；脱脂大豆酿造酱油的总酸含量较高，有研究表明，酱油有机酸主要来自原料和微生物的代谢，全大豆及脱脂大豆以柠檬酸为主，约占有机酸的70%～80%，其次是焦性谷氨酸、苹果酸、富马酸、琥珀酸及乙醇酸，但脱脂大豆中的总有机酸量比全大豆高1.5倍[9]，这可能是导致脱脂大豆酿造酱油总酸含量较高的原因；对比酱油色泽，脱脂大豆酿造酱油颜色较深，与其还原糖含量较高有一定关系，在氨基酸和还原糖的存在下，发酵酿造过程中容易产生美拉德反应，并生成褐色或黑色素物质。此外，脱脂大豆酿造酱油的还原糖含量较高[14]，可能原因是脱脂大豆比全大豆能更好地诱导淀粉酶增加。

根据感官鉴定标准，感官小组对全大豆酿造酱油和脱脂大豆酿造酱油进行了感官品评，结果如表2所示。

表2 全大豆酿造酱油和脱脂大豆酿造酱油感官评价Table 2 Sensory evaluation of soy sauce produced from whole soybeans and defatted soybeans

由表2可知，经感官鉴评，全大豆酿造酱油风味显著优于脱脂大豆酿造酱油。两种酱油相比，香气和滋味差异极显著，全大豆酿造酱油整体滋味协调，醇香、酱香浓郁，而脱脂大豆酿造酱油滋味一般，酸味较强，醇香和酱香较淡。此外，脱脂大豆酿造酱油的色泽较深。

2.2 全大豆酿造酱油和脱脂大豆酿造酱油主要挥发性成分比较

采用固相微萃取技术对酱油挥发性成分进行提取，并利用气相色谱-质谱法进行测定，全大豆酿造酱油和脱脂大豆酿造酱油的主要挥发性风味成分的总离子流图见图1。

图1 全大豆(A)和脱脂大豆(B)酿造酱油主要挥发性风味成分的总离子流图Fig.1 Total ion chromatograms of GC-MS analysis of the soy sauce produced from whole soybeans (A) and defatted soybeans (B)

由图1可知，全大豆酿造酱油的主要挥发性成分较丰富，物质的定性和含量差异（峰面积归一法）见表3。

由表3可知，本试验共鉴定出香气物质47种，其中醇类15种，酯类12种，酸类5种，酮类5种，酚类3种，醛类2种，吡咯类2种，其他3种。虽然全大豆酱油和脱脂大豆酱油挥发性风味成分是相同的，但其相对含量存在较大差异。

全大豆酿造酱油中酯类含量比脱脂大豆酿造酱油高，特别是其中的高级酯类物质，包括乳酸乙酯、十四酸乙酯、十六酸乙酯、十八酸乙酯、油酸乙酯、亚油酸甲酯和亚油酸乙酯。对比脱脂大豆酿造酱油，全大豆酿造酱油的原料大豆中含有约18%的油脂类成分，可能这些成分在酱醪中被微生物产的脂肪酶系或在自然氧化的条件下分解成游离的脂肪酸和甘油、单甘酯、甘油二酯，而大豆油脂的降解产物脂肪酸（即十二酸、十四酸、十五酸、十六酸、十八酸、油酸等）可进一步与发酵液中的醇类物质重新发生酯化反应生成新的酯类物质（如十四酸乙酯、十六酸乙酯等）。酯类物质（特别是乙基酯）不但具有果香，而且能够掩盖其他化合物散发出来的不良香气[15-16]。此外，脂肪酸在酿造后期继续氧化分解形成的小分子物质也可能是构成酱油复杂风味成分的重要来源。据研究表明，脂质在酿造过程形成特殊的风味成分在我国豉香型白酒香气成分的研究中已有大量报道，此酿造工序中需要加入“肥猪肉”浸泡陈酿，脂质的氧化使酒体带有浓郁的豉香味，同时由于酒中含有大量的乙醇，产生的高级脂肪酸乙酯能增加酒体的丰满感、延长后味，此种酒因浸泡猪肉脂肪产生独特的豉香风味而得名[17-18]。曾新安等[19]采用GC-MS技术进行分析，发现脂肪中的不饱和脂肪酸非常活泼，在酒中发生氧化分解等一系列反应，生产八碳、九碳等脂肪香味（肉香）小分子脂肪酸乙酯，除了β-苯乙醇外，脂质氧化形成的9,9-二乙氧基壬酸乙酯被认为是豉香型白酒中重要的特征香气成分。因此，由于风味成分的提取和检测方法的限制，只有部分酯类化合物被检测到，但对于全大豆酿造酱油浓郁的豉香风味与全大豆18%左右的油脂类物质在参与酱油风味物质的形成必然具有重要作用。

表3 全大豆酿造酱油和脱脂大豆酿造酱油主要挥发性成分比较分析Table 3 Comparison of the main volatile flavor components of soy sauce produced from whole soybeans and defatted soybeans

续表

在检测出的5种挥发性酸类物质中，全大豆酿造酱油中的乙酸、异丁酸和异戊酸含量较高，而己酸和辛酸的含量比脱脂大豆酿造酱油略低。一般来说，有机酸有增进风味的作用，除了主要依靠原料和微生物代谢产物的积累外，还有一部分作为微生物繁殖所需能源而被消耗掉。全大豆酿造酱油中的小分子酸含量较高，酸类化合物对酱油香气具有一定的缓和作用，一些低分子的酸类主要是由脂肪酸的进一步氧化降解生成的，也有部分是由乳酸菌和酵母发酵代谢作用产生的[9]。但对比表1中的酱油总酸，全大豆酿造酱油中的总酸含量较低，学者认为其理由是全大豆所生成的脂肪酸有抑制有机酸细菌类的产酸作用，而细菌却是发酵醪中产酸的主力，证明原料的不同会使产酸结果不同[9]。

酱油中共检测5种呋喃（酮）类化合物和2种吡咯（杂环）类化合物，这7种化合物在全大豆酿造酱油均有较高的含量。呋喃（酮）类化合物和杂环类化合物一般被认为是酱油特有的香气成分。3-羟基-2-丁酮具有强烈的奶油、脂肪、白脱样香气，高度稀释后有令人愉快的奶香气。呋喃（酮）化合物具有焦糖色香气，主要为酵母代谢及美拉德反应形成的产物[15，20-21]。表3的结果表明，以全大豆为原料的酿造酱油，更有利于呋喃（酮）类化合物和杂环类化合物的生成。

酱油中主要检测3种酚类化合物和2种醛类化合物。据研究表明，酚类化合物是在发酵过程中通过曲霉降解和酵母发酵生成，是酱油的重要风味成分。其中愈创木酚、4-乙基愈创木酚和4-乙基苯酚均是天然发酵酱油中的关键的香气物质[9]。由表3的检测结果可见，这三种酚类化合物在全大豆酿造酱油中均有非常高的含量。低分子质量挥发醛的2个主要来源是氨基酸降解和微生物的转化作用，在2种酱油中均检测到被认为具有焦糖和蜂蜜风味的化合物苯甲醛和α-亚乙基-苯乙醛[20]。全大豆酿造酱油中的苯甲醛含量偏低，但α-亚乙基-苯乙醛含量较高。

酱油中主要检测出15种醇类化合物，对比2种酿造酱油，全大豆酿造酱油中除了1,3-丁二醇、糠醇和苯甲醇外，其他醇类化合物的含量均较低。醇类化合物主要来自酵母代谢和大豆油脂的降解，是形成酿造酱油香气成分的重要来源[9]。全大豆酿造酱油和脱脂大豆酿造酱油中不同化学成分种类的相对含量比较见表4。

表4 全大豆酿造酱油和脱脂大豆酿造酱油中不同化学成分种类的相对含量比较Table 4 Relative contents of chemical compounds in different constituents of soy sauce produced from whole soybeans and defatted

由表4可见，脱脂大豆酿造酱油中仍含有较高的醇类化合物，这可能是脱脂大豆酱醪中酵母繁殖代谢后的产物由于缺少脂肪酸或小分子酸的酯化作用，仍然大量保存在酱油中，此结果可能是导致脱脂大豆酱油中的醇类物质的含量偏高的主要原因。

综合分析表明，全大豆和脱脂大豆的主要成分差异是有机溶剂浸出的油脂类物质，而酿制出酱油的风味却差异显著，通常采用全大豆制作的酱油其风味要优于采用脱脂大豆制作的酱油。通过比较分析2种酱油的挥发性风味化合物，全大豆酿造酱油中的酯类化合物、酸类化合物、酚类化合物及其他化合物均有非常高的含量。酯类化合物不但具有果香，而且高级酯类能使酱油具有浓厚味道，对增加后味是必要的。因此，全大豆油脂类物质在参与酱油风味物质的形成必然具有重要作用。根据脂质一般氧化分解规律，含不饱和脂肪酸的大豆脂质在晒露发酵过程中可氧化或环化成醛、酮、杂环化合物、内酯以及烷基呋喃等[7-8]，虽然这些成分可能含量很低，但由于口味阈值低，是不可忽视的风味成分[9]。另外，脂质降解生成的各种脂肪酸与酱醪中的乙醇重新生成小分子酯类，此类酯化合物具有芳香香气[10-11]。酱油中很多酸类化合物除了部分来自乳酸菌和酵母发酵代谢作用产生外，也来自脂肪酶对大豆油脂的降解，米曲霉等微生物产生的脂肪酶能将全大豆中的油脂降解为甘油和脂肪酸，脂肪酸进一步氧化降解成一些小分子酸，酸类物质对酱油香气具有一定的柔和作用[10，20]。美拉德反应作为酱油风味物质形成的重要途径之一，其反应过程十分复杂，反应产物众多，而且大豆脂质的氧化能提供大量的羰基化合物，这些中间产物在美拉德反应中必然存在相互作用，可能进一步形成酱油的风味成分。

3 结论

全大豆和脱脂大豆的主要成分差异是有机溶剂浸出的油脂类物质，而酿制出酱油的风味却差异显著，全大豆酿造酱油整体滋味协调，醇香、酱香浓郁，色泽棕红亮，而脱脂大豆酿造酱油滋味一般，酸味较强，醇香和酱香较淡，色泽较深。

2种酱油共鉴定出香气物质47种，其中醇类化合物15种，酯类化合物12种，酸类化合物5种，酮类化合物5种，酚类化合物3种，醛类2种，吡咯类2种，其他类化合物3种。虽然全大豆酿造酱油和脱脂大豆酿造酱油的挥发性风味成分是相同的，但其含量存在较大差异，全大豆酿造酱油中除了醇类和醛类化合物外，酯类化合物、酸类化合物、酮类化合物、酚类化合物、吡咯类化合物和其他类化合物的相对含量均比脱脂大豆酿造酱油高。因此，在全大豆酿造酱油和脱脂大豆酿造酱油的对比研究中，大豆油脂类物质是引起酿造酱油风味成分差异的主要原因。

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