南丽 姜丹 孔咪咪

(宁波海尔施基因科技有限公司 浙江 宁波 315800)

铂类药物是目前临床上最常用的肿瘤化疗药物之一，包括顺铂、卡铂和奥沙利铂等。据统计，在我国抗癌化疗治疗方案中，以顺铂为主或有顺铂参加配伍的方案占所有化疗方案的70% ～80%。但在铂类药物的临床应用中，却存在治疗有效率低和副作用大的问题，而且存在显著的个体差异。研究表明，人群对铂类药物的个体差异与多个单核苷酸多态性(SNP)密切相关。其中6 个基因的8 个SNP 位点:TPMT 的rs1142345 和rs18004601 位点、ERCC1 rs116152、XRCC1 rs254873、COMT 的rs4646316和rs93323771 位点、GSTP1 rs16954 及XPC rs22280015 尤其重要，用药前检测这些位点，可协助医生评估顺铂治疗后毒性风险、对患者是否有效及治疗后生存时间、总体生存时间及死亡风险。

本研究开发了一种用于铂类用药指导的多重基因检测试剂盒(以下简称:铂类试剂盒)，同步特异性扩增与铂类用药相关的6 个基因8 个SNP 位点的等位基因类型，为医生和患者提供了一种铂类用药指导的新型检测方案。

1.材料和方法

1.1 DNA 提取:以抗凝静脉血作为样本进行DNA 提取。DNA 提取在自动化提取工作站Smart LabAssist－32(台湾圆点奈米技术有限公司)上完成。试剂盒使用"核酸自动提取试剂盒(磁珠法)"(宁波海尔施基因科技，货号:1060055)。

1.2 PCR 扩增:PCR 扩增反应:铂类PCR 预混液16μL、Taq DNA 聚合酶2μL、样品DNA /铂类阳性对照2μL。混匀后按以下温度进行热循环反应:94℃3 分钟;94℃30 秒，60℃30 秒，70℃30 秒，共35 个循环;72℃3 分钟;4℃保存产物。

1.3 DNA 片段分离:采用遗传分析仪(3500/3130，美国生命公司或GeXP，美国贝克曼库尔特公司)进行DNA 片段分离，详见说明书。

2.结果

铂类试剂盒检测人DNA 样品，因每个SNP 位点有可能出现2 个基因型峰，故共可能出现12 －20 个特征峰，其中8 －16 个为SNP 特征峰、3 个人DNA 内参特征峰(BC－1、BC－3、BC－4)和1 个PCR 反应内参pcDNA特征峰(图1)。铂类阳性对照检测结果应出现全部20 个特征峰。

图1、本试剂盒检测人基因组DNA 结果举例。共出现16 个特征峰:8 个SNP 位点有4 个杂合子(XRCC1、TPMT－1、TPMT－2 和XPC)，即12 个基因型峰和4 个内参峰。

3.讨论

目前常用的SNP 检测方法:qPCR 法的优点是灵敏度高、准确性强，其缺点是通量低且探针成本高;DNA 芯片有高通量等优点，其缺点为成本昂贵、灵敏度低、重复性差且准确性低;Sanger 测序法是SNP 分析金标准，能发现已知SNP 和未知SNP，缺点是工作量大，周期长，多位点检测累计价格相对昂贵。

本研究提供了一种快速、准确同步检测多个SNP 位点用于指导铂类用药指导的新方法。目前，国内外尚无类似的研究报道。

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