杜民　牛宝珍　刘艳红　等

摘要：从50条随机引物中筛选出10条有效引物，采用RAPD技术对蒙自响水河和草坝的2个鲤鱼群体进行遗传多样性分析。结果表明：在2个群体中分别检测到47、53个位点，多态位点分别为44、51个，平均多态位点比例分别为93.61%和96.23%；利用Popgene version1.32软件分析获得2个鲤鱼群体Shannon信息指数（I）分别为0.479 9和0.455 7，Neis基因多样性指数（H）分别为0.328 7和0.298 4，等位基因观察数（Na）分别为1.821 4和1.910 7，有效等位基因数（Ne）分别为1.584 3和1.487 9，群体间的遗传相似性系数为0.958 1，遗传距离为0.041 9。2个鲤鱼群体间的遗传分化系数Gst为0.082 4，表明群体间的遗传变异占总的遗传变异的8.24%，群体内的遗传变异占总变异的91.76%。

关键词：鲤鱼；RAPD；遗传多样性

中图分类号： S917.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0047-03

收稿日期：2014-03-12

基金项目：国家自然科学基金（编号：31360638）；云南省教育厅科学研究基金重大专项（编号：ZD2013009）；红河学院中青年学术带头人后备人才项目（编号：2014HB0203）；红河学院博士专项（编号：14BS11）。

作者简介：杜民（1974—），男，湖北枣阳人，博士，副教授，主要从事水生生物技术与资源研究。Tel：（0873）3799787；E-mail：du2005min@126.com。

通信作者：刘艳红，博士，教授，主要从事水域资源与环境管理政策研究。Tel：（0873）3698575；E-mail：kidliu1968@126.com。自从随机扩增多态性DNA技术（Random Amplified Polymorphic DNA，RAPD）于1990年由美国科学家Williams等和Welsh等分别建立起来[1-2]以后，已在遗传多样性的检测、物种分类和演化、品种鉴定、种群的亲缘关系、构建鱼类遗传连锁图谱、鱼类育种和杂种优势等研究方面得到应用并且效果良好。陈国生应用RAPD技术分析了闽江中上游黑脊倒刺鲃和黄颡鱼遗传多样性[3]。赵凯利用RAPD技术对4种鲤科鱼类的基因组DNA进行了分析，结果表明鲤亚科2种鱼种间相似性明显高于青海湖裸鲤和草鱼种间的相似性，然而另外2个鲤亚科3种鱼与裂腹鱼亚科的青海湖裸鲤之间的差异显著高于鲤亚科鲤与雅罗鱼亚科草鱼、鲫鱼之间的差异[4]。

鲤鱼（Cyprinus carpio）属硬骨鱼纲（Osteichthyesu）辐鳍亚纲（Actinopterygii）鲤形总目（Cyprinomopha）鲤科（Cyprinidae），是一种最常见的淡水鱼，在各个淡水水域均有分布，也是我国淡水养殖的主要经济鱼之一。天然水域的污染和过度捕捞利用等原因造成鲤鱼栖息环境严重破坏，因此了解并保护鲤鱼种质资源显得极为迫切。本研究利用RAPD方法对云南省蒙自市响水河和草坝水体的2个鲤鱼群体进行分子遗传分析，探讨其遗传多样性，为鲤鱼资源的科学管理和合理开发提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

供试鱼来自于云南省蒙自市草坝水体和响水河水库，每个水体各采集6尾。取活鱼的尾鳍分别装入1.5 mL离心管中，加入无水乙醇并于4 ℃保存备用。

1.2方法

1.2.1试剂、仪器及基因组DNA提取Taq酶、dNTP、Marker 及10×Buffer（博迈德生物科技公司）；Tris酚（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）；PCR仪：EDC-810（东胜创新生物科技有限公司）；紫外透射仪：DYY-11（北京六一仪器厂）；高速离心机：HC-2062（安徽中科中佳科学仪器有限公司）。参照杜民等的方法[5]提取鲤鱼基因组总DNA并放于 -4 ℃ 冰箱。取5 μL DNA样品和适量溴酚蓝充分混匀后，利用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳后在凝胶成像系统进行检测，观察到鲤鱼基因组DNA条带比较清晰，符合RAPD实验要求（图1）。

1.2.2引物筛选及RAPD检测参照郭勇等三叶崖爬藤RAPD引物筛选[6]。以12尾鲤鱼的混合DNA为模板，从50条长度分别为10 bp的随机引物中（部分引物筛选的结果如图2所示），筛选出能扩增出清晰、条带数量适中的10条引物用于扩增（表1）。RAPD扩增反应程序： 94 ℃ 预变性2 min；然后35个循环（94℃变性30s，36℃退火 30s，72℃延伸

表110条随机引物的序列

引物 序列引物序列SBSA10GTGATCGCAGSBSC01TTCGAGCCAGSBSA16AGCCAGCGAASBSC02GTGAGGCGTCSBSB05TGCGCCCTTCSBSC04CCGCATCTACSBSB07GTGACGCAGSBSC07GTCCCGACGASBSB08GTCCACACGGSBSC08TGGACCGGTG

2 min）；最后72 ℃延伸5 min。取 5 μL 扩增产物在1%琼脂糖凝胶电泳，5 V/cm电压；用凝胶成像系统进行扫描和分析。

1.2.3数据统计分析记录清晰、明亮且重复性好的条带。将相同迁移距离的条带看作同一位点，统计总条带数与多态性条带数。根据产物的电泳带型，在相同迁移率上出现带的记为1，未出现带的记为0，只记录清晰且重复性好的DNA条带，并计算相关参数。根据Nei指数法[7]用Popgene1.32软件对2个鲤鱼群体的遗传多样性指数进行分析：（1）多态位点百分率=多态位点数/所测位点总数×100%；（2）遗传相似系数：F=2NXY/（NX+NY），其中NXY为2群体的共享位点数，NX为1群体的位点数，NY为2群体的位点数；遗传距离P：P=1-F；（3）基因流Nm=0.5（1-Gst）/Gst；（4）遗传分化指数Gst=（Ht-HPOP）/Ht，其中Ht为总群体的平均多样度，HPOP为各群体多样度的平均值。

2结果与分析

2.1RAPD扩增结果

用筛选到的10条引物对2个鲤鱼群体的基因组DNA进行PCR扩增，表2列出了10条引物序列的扩增情况。本试验2个群体中共扩增出100个位点，其中响水河鲤鱼群体总条带数为47条，其中多态性条带有44条，平均多态位点比例为93.61%；草坝鲤鱼群体总条带数为53条，其中多态性条带有51条，平均多态位点比例为96.23%，表明该群体遗传资源丰富，具有较好的遗传多样性。

2.22个鲤鱼群体的遗传多样性

2个鲤鱼群体多样性指数见表3。响水河鲤鱼群体和草坝鲤鱼群体Shannon信息指数（I）分别为0.479 9和0.455 7；Neis基因多样性指数（H）分别为0.328 7和0.298 4；等位基因观察数（Na）分别为1.821 4和1.910 7，有效等位基因数（Ne）分别为1.584 3和1.487 9。响水河鲤鱼群体的Shannon信息指数（I）高于草坝鲤鱼群体的Shannon信息指数。表210条RAPD引物对2个鲤鱼群体的扩增结果

引物序列总条带数（条）多态性条带数（条）多态性频率（%）响水河草坝响水河草坝响水河草坝SBSA10GTGATCGCAG05050100SBSA16AGCCAGCGAA666510088.33SBSB05TGCGCCCTTC431375100SBSB07GGTGACGCAG6565100100SBSB08GTCCACACGG666510088.33SBSC01TTCGAGCCAG5656100100SBSC02GTGAGGCGTC5555100100SBSC04CCGCATCTAC5555100100SBSC07GTCCCGACGA6666100100SBSC08TGGACCGGTG4646100100合计4753445193.6196.23

表32个鲤鱼群体多样性指数

群体Shannon信息指数Neis基因多样性响水河0.479 9 0.328 7草坝0.455 7 0.298 4总的0.515 50.341 7

2.3群体间的遗传变异分析

根据总的基因多样性（Ht）和群体内基因多样性（Hs）可以推算出群体间分化水平（Gst）。本研究的2个鲤鱼群体间的遗传分化系数Gst为0.082 4，即群体间的遗传变异占总遗传变异的8.24%，群体内的遗传变异占总变异的91.76%，显示出2个群体间不存在明显的遗传变异（表4）。

表42个鲤鱼群体遗传分化与基因流

指标总的基因多

样性（Ht）群体内基因

多样性（Hs）遗传分化

系数（Gst） 基因流

（Nm）平均 0.341 70.313 5 0.082 4 5.569 0标准差 0.015 60.014 9

2.4群体间的遗传关系分析

依据10个有效引物进行PCR扩增的结果，计算出2种鲤鱼群体间的遗传相似性指数和遗传距离如表5所示。响水河和草坝2个群体的遗传相似性系数为0.958 1，遗传距离为0.041 9。

表52个鲤鱼群体间的相似性（右上角）和遗传距离（左下角）

群体 响水河草坝响水河 ****0.958 1草坝0.041 9 ****

3讨论

3.12个鲤鱼群体的遗传多样性

RAPD标记操作简单、方便、快速并且引物具有随机性[8-9]，现已广泛应用于水生经济动物的遗传多样性研究，如张涛等对汉江上游鲫鱼研究其多态位点比例为67.77%[10]；方耀林等对长江水系的3个青鱼群体进行研究，结果表明多态性位点比例为75%[11]；励迪平等报道曼氏无针乌贼的多态性位点比例为14.6%，平均杂合度Ho为0.032[12]，所得出的曼氏无针乌贼的遗传多样性是比较低的；朱学峰研究发现广西中华草龟的多态位点比例为66.29%，广西中华草龟的遗传多样性比较丰富，但是个体间的亲缘关系比较近，遗传变异程度很小[13]；张伟等对东南太平洋智利竹鱼研究发现多态位点比例为98.08%，Neis基因多样性指数为0.350 0±0144 0，群体的Shannon信息指数为0.520 2±0.181 3，遗传分化指数Gst为0.031 1，结果表明该海域智利竹鱼群体的遗传多态性比较高，但群体间不存在明显的遗传分化[14]；张学明等研究发现北海文昌鱼Shannon信息指数为 0.219 0[15]。本试验筛选出10条引物进行PCR扩增，利用RAPD技术对响水河和草坝鲤鱼群体进行遗传多样性分析，表明2个群体的平均多态位点比例分别为93.61%和9623%，Shannon信息指数分别为0.479 9 、0.455 7，表明响水河和草坝2个鲤鱼群体遗传多样性比长江铜鱼、武汉市场购回的普通鲫鱼、汉江上游鲫鱼、长江水系青鱼、曼氏无针乌贼、广西中华龟的遗传多样性丰富，但没有东南太平洋智利竹鱼遗传多样性丰富。

3.22个鲤鱼群体之间的遗传差异

Thorpe研究认为，同种不同群体间遗传距离D在0.03～0.2之间，遗传相似度（I）在0.80～0.97之间，不同物种间遗传相似度（I）在0.2～0.8之间[16]。本研究中，2个鲤鱼群体间的基因分化系数Gst为0.082 4，表明8.24%的遗传变异来自于群体间，群体内的遗传变异占总变异的91.76%，这说明这2个区域群体之间不存在显著的遗传分化，但不同群体间存在一定的遗传分化。响水河和草坝2个鲤鱼群体的遗传相似度较高（0.958 1），遗传距离D为0.042 9，大于0.03小于0.2，表明2个群体间存在一定的遗传分化。本研究获得的遗传多样性数据可以对今后红河州鲤鱼遗传变异水平及其变化趋势分析提供参考。

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doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2015.01.015