李宗平，张俊杰，彭　灏，陈茂胜，杨丽萍，徐世平，王文明，郭宇龙

（湖北省烟草科学研究院，中国烟草白肋烟试验站，武汉 430030）

烟草花粉冷冻干燥方法研究初报

李宗平，张俊杰，彭灏，陈茂胜，杨丽萍，徐世平，王文明，郭宇龙

（湖北省烟草科学研究院，中国烟草白肋烟试验站，武汉 430030）

摘要：采用多因素试验方法对烟草花粉冷冻干燥中的预冻时间、抽真空干燥时间和预冻前添加防冻剂等3个因素进行了研究。结果表明，3个因素对花粉干燥均有显著的影响，对花粉活力及授粉后的坐果率影响较小；抽真空干燥时间是影响花粉干燥的主要因素；预冻时间与抽真空干燥时间的互作效应较大。认为烟草花粉冷冻干燥处理，以预冻时间2～3 h，抽真空时间12 h左右为宜，一般不需添加防冻剂。

关键词：烟草花粉；冷冻干燥；水分散失率；花粉活力；坐果率

随着烟草产业的不断发展，烟草雄性不育杂交种的推广种植已逐步成为烟叶生产的主导方向［1-4］。近年来，随着介质花粉、烟草杂交授粉新方法等技术的研发及应用［5-6］，花粉贮藏已成为杂交制种过程的一个重要生产环节。在众多影响贮藏花粉活力及寿命的因素中，贮藏的温度和相对湿度是主要关键［7］。为此，提高贮藏花粉活力的研究大多集中在贮藏条件的改善等方面，如硅胶干燥贮藏、低温贮藏、超低温贮藏等［8-14］。

冷冻干燥技术其原理是先让物料内的水分完全冻结，再在一定的低温真空条件下使冻晶升华，从而达到脱水的目的。其优点是干燥彻底，能排查95%～99%的水分；物料的活性成分损失小，复水后其形态、生理机能迅速恢复；对贮藏条件要求不严，密封后在室温下亦能长期贮藏。该技术现已广泛用于保存生物制剂、医药产品、文物保护、食品加工等方面［15-16］。李兴诗等［17］对白菜、泡桐的花粉研究结果认为，冷冻干燥后的花粉在室温保存30～45 d仍有较高的活力。目前，利用冷冻干燥技术贮藏烟草花粉鲜见报道。

本研究旨在通过对冷冻干燥中的预冻时间、真空干燥时间及添加冷冻保护剂等方面的试验，为烟草杂交制种过程中大批量的花粉贮藏提供方法及依据。

1　材料与方法

1.1试验材料

白肋烟B37的花粉。

1.2试验方法

2012年7月5—15日在中国烟草恩施良种繁育基地，采集白肋烟B37的花粉，放在有硅胶的干燥器中，密封后再放入低温冰柜中备用。7月20、21、22日分组取样先检测处理前水分、再进行冷冻干燥处理，然后取样检测处理后水分和花粉活力，7月23日，取冷冻干燥处理前（对照）和处理后的花粉进行田间授粉试验，授粉后7 d即7月30日调查田间坐果率。

1.2.1试验设计采用3因素3水平即L9（34）正交试验表设计。A因素：预冻时间；B因素：抽真空时间；C因素：添加防冻剂。3次重复，共27个处理，每处理4 g花粉。各因素水平设定及试验处理设计详见表1。

表1　试验处理设计L9（34）正交表Table1　Orthogonal table with design of experimental treatment L9（34）

1.2.2冷冻预冻及干燥方法用北京博医康生产的FD-1A-50冷冻干燥机进行冷冻干燥。花粉先在冷冻机的冷阱中预冻，温度-50～-55℃，达到预定时间后取出，平摊在冷冻干燥机的物料盒中进行真空干燥。花粉厚度＜10 mm，温度-45～-50℃，气压稳定在8～10Pa。

1.2.3水分检测及水分散失率计算MA150红外水分测定仪检测冷冻干燥处理前后的花粉水分含量，4次重复，每次0.5g花粉。计算水分散失率。公式：

花粉水分散失率/%=［（处理后水分－处理前水分）/处理前水分］×100%。

1.2.4花粉活力检测采用离体萌发培养法检测花粉活力。培养液为葡萄糖3 mg+硼酸50mg+氯化钙20 mg+1000 mL水［18］。电热恒温箱温度28 ℃、培养时间2 h。显微镜统计花粉萌发率。用显微标尺测量花粉管长度，花粉管长度大于花粉粒2倍为有效粒数，4次重复，取加权平均值。花粉萌发率/%=萌发有效数/花粉粒总数×100%［10］。

1.2.5田间杂交授粉及坐果率统计冷冻干燥后的花粉在温度25～28℃、相当湿度95%的生物培养箱内复水0.5h后［17］，分别与MSB21进行杂交授粉，每处理5株，4次重复，7 d后统计授粉坐果率，取加权平均值。坐果率%=青果数/授粉花数× 100%。

2　结果

2.1不同处理对水分散失率的影响

花粉水分含量是影响花粉储藏时间、花粉活力的关键因素之一。冷冻干燥的目的是利用冷冻干燥的原理尽多的排出花粉内的水分、抑制酶的活性、延长花粉寿命。在本试验中A、B、C三个因素和因素间的水分散失率效应互作效应均达极显著水平。B因素是影响水分的主要因素，其次是A因素，C因素影响最小。在A因素中，有随预冻时间的增长花粉水分散失率增大的趋势，A3（4 h）显著高于A1（2 h）；B因素中，随抽真空时间的增长花粉水分散失率大幅增加的趋势，B3（12 h）＞B2（8 h）＞B1（4 h），差异均达极显著水平；C添加防冻剂各水平间差异不显著（表2）。

表2　水分散失率 %Table2　The water lossrate %

表3　水分散失率互作效应 %Table3　Interaction effect of water lossrate %

进一步分析因素互作效应，在A因素的不同水平下，B因素和C因素的水分散失率差异较小，有随预冻时间的延长，水分散失率增大的趋势；A因素同一水平下，B因素和C因素的各水平间的差异较大，差异均达极显著水平。由此认为，在同等A因素下，B因素是水分散失的主要因素，其影响大于C因素。详见表3。

在B因素的不同水平下，A因素和C因素水分散失率为34.26%～98.10%和38.20%～97.90%，进一步说明B因素是水分散失的主要因素；B因素同一水平下，A因素和C因素的水分散失率差异相对较小。

在C因素不同水平中，B因素水平间的水分散失率差异大于A因素。其中，B因素不同水平的水分散失率差异较大均达显著或极显著水平。

2.2不同处理对花粉活力的影响

花粉活力的方差分析结果，因素间的差异未达显著水平，但A因素与B因素间、C因素间的互作效应达显著水平。各因素不同水平间花粉活力差异显著性分析结果如表4所示。B因素中B3（12 h）的花粉活力显著高于B1（4 h）；A因素和C因素的3个水平间花粉活力差异未达显著水平。说明抽真空时间对花粉活力有一定的影响。

表4　花粉活力 %Table4　The pollen vitality

表5　花粉活力互作效应 %Table5　Pollen viabilityinteraction %

各处理间的花粉活力互作效应分析结果表明，在A因素的不同水平下，B因素水平间花粉活力差异大于C因素。其中，A1（2 h）中B和C因素的花粉活力呈下降趋势，在A2（3 h）、A3（4 h）中则呈上升趋势。在B因素不同水平下，A因素水平间花粉活力差异大于C因素，其中在B1、B2中A因素的花粉活力呈下降趋势，在B3中呈上升趋势；C因素的水平间的花粉活力差异未达显著水平。在C因素不同水平下A因素和B因素水平间的花粉活力差异不大。各因素及水平间差异显著性分析结果详见表5。

2.3不同处理的田间坐果率比较

不同因素的坐果率方差分析表明，各因素对花粉授粉的田间坐果率影响不大，差异未达显著水平。据表6所示，A、B、C因素的3个水平间的差异均未达显著水平。

表6　坐果率 %Table6　Setting rate %

3　讨论

一般预冻时间的长短与物料共晶点、预冻温度及冻结速率等有关［15-16，19］。有报道认为大多农作物组织的共晶点在-20～-40℃，预冻温度比共晶点低5～20℃，预冻时间一般为2～4 h［15，19-21］。本试验结果与之基本一致。烟草花粉的共晶点、预冻温度、冷冻速率及花粉密度等参数及单位面积花粉的堆积厚度与预冻时间的关系等均有待进一步研究。

真空干燥是利用低温低压下传质传热原理，使冰直接升华为水蒸气，再用真空系统中的水汽凝结器将水蒸气冷凝，从而获得干燥制品。抽真空时间及干燥效果与升华温度、升华速率、加热方式、真空度、及物料厚度有关。本研究中花粉平摊厚度1 cm以内，升华温度-45～-50℃，气压稳定在8～10Pa，满足了花粉水分升华的条件，抽真空时间12 h左右能排除花粉97%～98%的水分，与前人研究的水分升华速度在1 mm/h左右的结论一致［15-16］。

预冻前添加防冻剂能防止冷冻干燥过程中因低温效应、冷冻效应和脱水效应影响物体的活性成分变性［16］。对于诸如眼角膜等活性生物体的保存或生物标本冷冻干燥中，选取保护剂是冻干过程的关键技术［22］。目前对于冰冻保护剂的作用机理尚未了解透彻。且保护剂的种类很多，不同生物制品需用的不同的保护剂。目前常用的冷冻保护剂有二甲基亚砜（DMSO）、甘油、糖和糖醇等，有报道认为在紫菜薹花粉超低温保存中以DMSO和蔗糖为主， 其中蔗糖浓度对花粉保存效果有明显的影响［23］。在本研究中，冷冻干燥前添加防冻剂对花粉干燥及花粉活力无明显的影响，添加防冻剂的花粉复水后，易结团，不利田间人工授粉操作。

本研究中仅对冷冻干燥后的花粉进行了活力检测和田间授粉后的坐果率统计，对其成分、形态、结构和各酶的活性等方面的变化尚需进一步研究。

4　结论

利用冷冻干燥技术进行烟草花粉干燥是可行的。在保证花粉较高活力的前提下，能排查花粉内97%～98%的水分，有利于花粉长期储藏。在冷冻干燥过程中，以预冻温度-50～-55℃，预冻时间2～4 h，抽真空时间12 h左右为宜。

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中图分类号：S572.03

文章编号：1007-5119（2015）02-0038-05

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2015.02.007

基金项目：湖北省烟草专卖局项目“经济、高效烟草种子生产技术研究”（027Y2011-051）

作者简介：李宗平，男，高级农艺师，长期从事烟草良种繁育工作与研究。E-mail：li63@163.com

收稿日期：2013-09-30修回日期：2015-04-01

Preliminary Report on the Freeze-drying Method for Tobacco Pollen

LI Zongping， ZHANG Junjie， PENG Hao，CHEN Maosheng， YANG Liping， XU Shiping，WANG Wenming， GUO Yulong
（Tobacco Research Academy of Hubei Province， Burley Tobacco Experimental Station of CNTC， Wuhan430030， China）

Abstract:Multi-factor test method for freeze-drying of tobacco pollen， pollen pre-freezing time， vacuum drying time and add antifreeze before pre-freezing three factors were studied. The results showed the three factors significantly affected pollen drying，pollen viability and pollination on fruit setting rate.Vacuum drying time was the main factors affecting pollen.Pre-freezing time and vacuum drying time had great interaction. Tobacco pollen freeze-drying without adding antifreeze， pre freezing time was 2～3h，vacuum time was12h.

Keywords:tobacco pollen； freeze-drying；water loss rate； pollen viability；fruit setting rate