闫　宁，龚达平，张忠锋

（中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101）

烟草甾醇合成代谢分子调控研究进展

闫宁，龚达平，张忠锋*

（中国农业科学院烟草研究所，青岛 266101）

摘要：烟叶中的甾醇在卷烟燃烧过程中生成致癌物-多环芳烃（PAHs）。笔者主要阐述了植物甾醇在卷烟减害研究、调控植物生长发育和响应植物胁迫中的作用，重点介绍了植物甾醇合成代谢途径以及该途径中的关键酶基因。

关键词：甾醇生物合成；多环芳烃；生长发育；逆境胁迫；关键酶

甾醇（sterol）属于大分子醇类，是自然界中广泛存在的一类甾族化合物。自然界中的甾醇根据其来源分为动物甾醇、菌甾醇和植物甾醇。其中，动物甾醇中最常见的为胆固醇（cholesterol），已有研究发现，胆固醇在植物的种子以及根、茎、叶、花中也普遍存在［1］。菌甾醇中最常见的为麦角甾醇（ergosterol），它主要存在于霉菌和蘑菇中［2］。植物甾醇是生物膜系统的重要组成成分，常见的植物甾醇有豆甾醇（stigmasterol）、谷甾醇（sitosterol）、菜油甾醇（campesterol）、燕麦甾醇（avenasterol）和菠菜甾醇（spinasterol）等［3］。植物甾醇是一类重要的生理活性物质，除了调控植物生长发育外，还响应多种生物和非生物胁迫［4］。

甾醇是烟草中一类重要的化合物，甾醇类物质约占烟叶质量的0.1%～0.3%，由于甾醇的结构中都含有羟基，热解时其母体的四轮环戊烯［α］菲环结构可形成致癌物-多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons， PAHs），因此烟草中的甾醇是一种潜在的影响人体健康的物质［5-7］。降低烟草成熟叶片中甾醇含量有望成为降低卷烟危害的有效途径。本综述的目的在于总结烟草甾醇合成代谢途径以及该途径中的关键酶基因，提出通过基因工程手段降低甾醇合成代谢基因表达进而降低烟叶中甾醇含量的方法和思路，为低甾醇烟草育种提供借鉴。

1　烟草中植物甾醇的存在、类型以及对卷烟安全性的影响

烟草中的植物甾醇主要有豆甾醇、β-谷甾醇、菜油甾醇和胆固醇［8］，霉变的烟叶中还含有麦角甾醇［9］。

在烟草中，豆甾醇、β-谷甾醇含量较高，菜油甾醇含量次之，胆固醇含量最低［10］。甾醇类在烟草中以游离态（FS）和结合态存在，结合态包括与脂肪酸形成甾醇酯（SE），以及与糖类形成的甾醇糖苷（SG）和酰基甾醇糖苷（ASG）［11］。

烟草中植物甾醇主要存在于细胞膜中，不但能促进烟草生长，而且对烟草的安全性和品质有较大的影响。卷烟烟气是一种极其复杂的混合物，它是在卷烟抽吸过程中由烟草燃烧、裂解和蒸馏而产生的［12］。在烟草和烟气中鉴定出的5000多种化合物中，有害和致癌成分仅100多种，以苯并［α］芘、苯并［α］蒽和Chrysene为代表的多环芳烃属于完全致癌的化合物［13］。和食品和其他植物中的甾醇不同，烟草甾醇在卷烟抽吸时约有20%～25%完整的转移到主流和侧流烟气中，甾醇中的羟基在高温热解时会与其母体的四轮环戊烯［α］菲环结构形成多环芳烃［5-6］。刘少民等［14］研究表明，游离甾醇的总量与主流烟气中PAHs的释放量和苯并［a］芘的释放量都呈显著正相关，其中豆甾醇、麦角甾醇对苯并［α］芘的贡献较大。Schmeltz等［15］将烟草植株放在放射性的14CO2环境下生长，从成熟烟叶中提取出包括甾醇类化合物在内的多种含有放射性标记碳的组分添加到卷烟中，通过放射性产物的质谱鉴定在卷烟烟气中检测到14C标记的苯并［α］芘。Stedman［16］研究表明，豆甾醇在750℃下热解生成苯并［α］芘；Badger等［17］研究表明，在豆甾醇的裂解过程中，甾醇骨架经过一系列单分子反应后形成了菲、蒽等多环芳烃。

2　植物甾醇在调控植物生长发育和响应逆境胁迫中的作用

植物甾醇是一类重要的生理活性物质，不仅在调控植物的生长发育中具有重要作用，而且对响应植物逆境胁迫也具有重要功能。植物甾醇是生物膜系统的重要组分，与膜的稳定性密切相关；植物主要通过调控甾醇含量变化维持膜的稳定性及影响脂质筏的生物功能响应逆境胁迫［4］。下面分别介绍植物甾醇在调节植物生长发育和响应生物胁迫、非生物胁迫中的作用。

2.1 植物甾醇在调控植物生长发育中的作用

植物甾醇主要存在于细胞膜上，在细胞膜中的存在形式有游离型和结合型（与脂肪酸或糖结合），它可以影响膜的流动性和渗透性［18］。对拟南芥甾醇生物合成缺失突变体的研究表明，植物甾醇在细胞伸长、纤维素合成和细胞壁形成过程中具有重要作用，而且细胞膜中适宜的甾醇组成对酶活性、离子和代谢物的运输、蛋白质与蛋白质或蛋白质与脂类物质的相互作用、信号转导和膜的流动性等方面有非常重要的影响［19-21］。植物甾醇还可以改变植物激素对细胞骨架调控的信号转导，从而影响许多细胞发育的相关过程［22］。植物甾醇具有促进细胞伸长的生理功能，表现在其缺失突变体和不敏感突变体都表现为植株矮化、叶柄缩短等，其主要原因是细胞伸长受到抑制［20］。Schrick等［21］研究发现，植物甾醇合成被扰乱后纤维素含量明显下降，而且一些甾醇抑制剂（例如，15-azasterol和fenpropimorph）也能导致纤维素含量显著降低。Peng等［23］研究发现，谷甾醇是纤维素合成的引物，UDP-葡萄糖首先与谷甾醇结合形成谷甾醇-β-葡萄糖苷才开始纤维素的延伸，这一研究结果为谷甾醇在纤维素合成中的作用提供了直接的证据。

2.2 植物甾醇响应生物胁迫

植物甾醇可以通过防御反应识别病原菌，然而疫霉属病原菌不能合成甾醇，只能依赖从宿主植物中获得甾醇［24］。Kopischke等［25］研究发现，疫霉属病原菌侵染拟南芥磷脂：甾醇酰基转移酶（erp1）突变体后，相对于野生型植株，其自由甾醇含量无明显变化，SG含量升高2倍，ASG含量显著降低，突变体植株的疫霉属病原菌抗性降低。这说明结合甾醇含量的变化对病原菌的防卫反应有重要作用，植物可通过减少对寄生性疫霉属甾醇的供应增强植物对疫霉属病原菌的抗性。白粉病菌侵染拟南芥和大麦后，细胞膜脂质筏区域的甾醇大量积累［26］。细菌性病原菌侵染拟南芥后，叶片豆甾醇含量增加，豆甾醇又能够激活质膜上H+-ATPase，改变细胞膜的结构和功能，以响应免疫反应［27-28］。Griebel和Zeier等［27］研究发现，植物细菌性角斑病激活甾醇去饱和酶基因的表达，豆甾醇含量增加，并且抑制病原菌诱导的防卫反应调控子黄素依赖型单加氧酶的表达。总之，植物通过调控植物甾醇合成酶的表达控制甾醇含量的变化，从而引起细胞膜结构和功能的改变以响应病原菌的侵染。

2.3 植物甾醇响应非生物胁迫

植物甾醇在响应盐胁迫、温度胁迫等非生物胁迫中有重要的作用。在盐胁迫下，拟南芥中的菜油甾醇与豆甾醇的含量分别降低13%和6%，而谷甾醇含量增加5%，谷甾醇/豆甾醇比值由2.149上升至2.372，谷甾醇/豆甾醇的比值的提高有利于盐胁迫下细胞膜功能的调节，增强耐盐性［29］。Grandmougin等［30］证明在盐胁迫下特定的植物甾醇可以调控细胞膜结合的H+-ATPase的活性，低浓度的豆甾醇和胆固醇可以刺激质子的外排，而24-甲基胆固醇和谷甾醇则起抑制作用。Erick和Dufourc［31］研究发现在高温和低温胁迫下植物中的甲基甾醇大量转化成乙基甾醇（谷甾醇和豆甾醇），这种甾醇组成的变化有利于增强细胞膜的内聚力，调节植物体的温度变化，以适应高温和低温环境。Manish［32］研究表明，低温环境促进了植物甾醇的积累，同时发现高温和低温环境下植物甾醇浓度与土壤pH和碳水化合物含量变化是一致的，但与植物蛋白和苯酚含量变化是相反的。植物甾醇在内质网中合成，然后从内质网运输到细胞膜，这种转运在低温环境下被阻断［33］。另外，植物甾醇还响应光照、干旱、ABA等非生物胁迫。Mariana等［34］研究发现低剂量UV-B照射葡萄时，豆甾醇、谷甾醇含量增加，且谷甾醇/豆甾醇比值增加了7倍。在干旱胁迫下，植物甾醇以其独特的分子结构调节细胞膜的流动性和通透性抑制水分流失［35］。植物甾醇能抑制由ABA所引起的膜透性的提高，从而最终维持细胞膜的正常功能［36］。因此，在盐胁迫、温度胁迫、光照胁迫、干旱胁迫和ABA等非生物胁迫下，植物中甾醇的组成及其在细胞的不同结构中转运的变化有助于维持细胞膜的正常生理功能，以响应非生物胁迫。

3　 植物甾醇的合成代谢途径

植物甾醇合成的第一个阶段是由3个乙酰-CoA分子经过6C的3-羟基-3-甲基戊二酰-CoA（HMG-CoA）和6C的甲羟戊酸（MVA）形成5C的异戊烯基焦磷酸（IPP）分子。乙酰-CoA在HMG-CoA合成酶的作用下形成HMG-CoA，HMG-CoA在HMG-CoA还原酶的作用下形成MVA，MVA在甲羟戊酸激酶的作用下形成5-磷酸甲羟戊酸，5-磷酸甲羟戊酸在磷酸甲羟戊酸激酶的作用下形成5-焦磷酸甲羟戊酸，5-焦磷酸甲羟戊酸在5-焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶的作用下形成IPP（图1）。甾醇合成的第二个阶段是IPP分子聚合，经过C10的牦牛儿基焦磷酸（GPP）和C15的法尼基焦磷酸（FPP）形成的C30的鲨烯（squelene）。IPP在异戊烯基焦磷酸异构酶的作用下形成二甲基丙烯基焦磷酸（DMAPP），DMAPP在异戊烯基转移酶的作用下形成GPP，GPP在法呢基焦磷酸合酶的作用下形成FPP，FPP在鲨烯合酶的作用下形成鲨烯（图1）。应该指出的是，对植物、真菌和动物细胞来说，甾醇生物合成途径中从乙酰-CoA到鲨烯阶段是相同的。然后，在动物和真菌中，鲨烯分子环化形成30C的羊毛甾醇（lanosterol）；而在植物体内则形成环阿屯醇（lanosterol）的C30前体。最后，动物和真菌30C的羊毛甾醇形成27C的胆甾醇；植物体内的环阿屯醇在一系列酶的作用下形成豆甾醇、谷甾醇和菜油甾醇等（图1）［37］。植物甾醇和动物甾醇（胆固醇）的区别是C-24位置多了额外的烷基，这个过程由甾醇甲基转移酶（SMTs）完成［4］。SMTs

Nicotiana langadorffii杂交种的FPS基因的核酸序列同源性分别为74%、76%、77%、80%和97%。FPP不仅是植物甾醇的合成前体，同时还可在烟草倍半萜环化酶：马兜铃烯合成酶的作用下生成包括植保素在内的倍半萜衍生物［47］，因此通过基因工程手段调控烟草甾醇合成代谢可能会影响烟草倍半萜类植保素的含量。崔红等［48］研究发现，薄荷FPS基因转入烟草后，烟株对赤星病的抗性增强。李雪君等［49］将薄荷FPS基因转入烟草中，烤后烟叶中8种类胡萝卜素降解产物、茄酮、新植二烯含量比对照都有不同程度的提高，综合评吸较好。

4.3 鲨烯合酶

鲨烯合酶（squalene synthase），简称SQS，它催化两分子的FPP合成鲨烯（图1）。鲨烯合酶在甾醇的生物合成中起着关键的作用，这在酵母菌甾醇合成代谢中已被证实［50］。Threlfall等［51］研究表明，利用真菌诱导子处理烟草的愈伤组织会降低愈伤组织中鲨烯合酶活性和植物甾醇含量。Devarenne等［52］研究表明，鲨烯合酶的调控可能发生在从转录到翻译后加工的多个水平上。Wentzinger等［53］发现，用鲨烯合酶和鲨烯环氧酶的特异性抑制剂squalestatin-1和terbinafine处理烟草细胞的悬浮系，都能够提高细胞中HMGR的酶活性。Kim等［54］研究发现烟草、拟南芥和人参SQS基因具有3个高度保守区域，被认为是与SQS酶活性相关的区域。Manavalan等［55］发现，RNAi抑制水稻SQS基因后，在缺水条件下，植株生物量和籽粒产量提高，叶片气孔导度降低，抗旱性提高。最近，陈千思等［56］克隆到烟草SQS基因，并将构建好的病毒介导的基因沉默载体接种本氏烟草，发现该基因沉默植株中甾醇含量下降了41.26%，这说明沉默SQS基因可以显著降低烟草甾醇含量。

4.4 鲨烯环氧酶

鲨烯环氧酶（squalene epoxidase），简称SQE，是一种细胞膜结合酶，催化鲨烯合成鲨烯2，3-氧化物（图1），是甾醇生物合成途径中的限速酶之一。在酵母菌中，鲨烯环氧酶在内质网和脂质粒中均有表达［57］。Hideyuki等［58］从蒺藜状苜蓿中分离出SQE1和SQE2，它们均可补充了酵母菌突变菌株KLN1中麦角甾醇的生物合成，这表明SQE1和SQE2都参与了蒺藜状苜蓿中甾醇的生物形成。在人参三萜皂苷生物合成研究中，Choi等［59］发现了3个编码SQE的转录物，这表明在人参基因组中SQE构成了一个小的多基因家族。Han等［60］研究发现，抑制SQE1基因后人参根系中的三萜皂苷含量降低，但SQE2和环阿屯醇合酶基因表达量却提高，进而导致植物甾醇含量提高。最近，陈千思等［61］克隆到烟草SQE基因，研究发现SQE在烟草幼嫩组织中特异性的高表达，将构建好的病毒介导的基因沉默载体接种本氏烟草，发现该基因沉默植株中甾醇含量下降了21.37%。

4.5 环阿屯醇合酶

环阿屯醇合酶（cycloartenol synthase），简称CAS，它催化鲨烯2，3-氧化物形成环阿屯醇（图1）。环阿屯醇是植物甾醇生物合成的前体物，因此CAS是甾醇生物合成的一个关键基因。目前，多种植物的CAS cDNA序列已经被克隆，其中包括拟南芥［62］、西葫芦［63］和水稻［64］等。CAS基因缺失后，拟南芥β-谷甾醇含量降低，鲨烯2，3-氧化物含量升高［65］；抑制人参CAS基因后，植物甾醇含量降低约50%，三萜皂苷含量提高50%～100%［66］。鲨烯2，3-氧化物形成甾醇存在2种途径：植物中主要是通过CAS催化形成环阿屯醇进行，酵母菌和动物中是通过羊毛甾醇合酶（LAS）催化形成羊毛甾醇进行［37］。因此，在LAS基因缺失的酵母菌中，可以利用酵母异源互补法对烟草CAS基因进行功能验证［62］。

5　展望

烟草甾醇是卷烟烟气中多环芳烃的主要前体物，通过转基因技术或瞬时表达技术干扰、沉默或敲除烟草甾醇合成代谢关键基因，可以获得甾醇含量降低的烟草转化植株［56，61］。笔者通过归纳总结植物甾醇合成代谢途径及该途径中的关键酶基因，为利用基因工程手段降低卷烟危害探索可行性的方法和思路。同时，植物甾醇是一类重要的生理活性物质，不仅对调控植物生长发育具有重要作用，而且在响应植物生物胁迫和非生物胁迫中发挥重要作用。因此，通过基因工程手段调控植物甾醇合成代谢关键酶基因的表达，有望在提高烟草应对逆境胁迫能力方面发挥作用。

综上可见，将来的研究可以从完善烟草甾醇合成代谢途径入手，开展烟草甾醇合成代谢关键酶基因的克隆、表达分析和调控机制等的研究。通过对烟草甾醇合成代谢相关酶的性质以及相关基因异源表达的酶活性和反应动力学分析，确定烟草甾醇合成代谢的关键酶基因。同时，利用基因工程原理与技术构建、筛选甾醇敏感株突变体，研究相关酶基因在烟草甾醇合成代谢途径中的作用。另外，植物甾醇响应逆境胁迫的生理机制比较复杂，以后应该重点研究植物甾醇合成酶的表达调控与植物甾醇含量变化的相关性，探索植物甾醇合成关键酶基因在植物响应逆境胁迫中的作用。

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中图分类号：TS413

文章编号：1007-5119（2015）02-00110-08

DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2015.02.020

基金项目：中国烟草总公司科技重大专项项目“烟草低苯并芘突变体的筛选和基因定位研究”（110201401008CJT-08）

作者简介：闫宁，男，博士，助理研究员，主要从事烟草功能成分与综合利用研究。E-mail：yanning5110@163.com

*通信作者，E-mail：zhangzhongfeng@caas.cn

收稿日期：2014-05-14修回日期：2014-06-30

Advances in the Molecular Regulation of Tobacco Sterol Biosynthesis Metabolism

YAN Ning， GONG Daping， ZHANG Zhongfeng*
（Tobacco Research Institute of ChineseAcademy of Agricultural Sciences， Qingdao 266101， China）

Abstract:Plant sterols in tobacco leaves can generate the carcinogen - polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs） in the combustion process of cigarette. In this article， the roles of plant sterols in tobacco harm reduction research， the regulation of plant growth and development， and the response to plant stress were primarily discussed， and the plant sterol biosynthetic pathway and key enzymes in this pathway were mainly introduced.

Keywords:sterol biosynthesis； polycyclic aromatic hydrocarbon； growth and development； stress； key enzyme