张 月　王 敏　胡莉萍　李玉杰　孔祥华　曹振山　姜秀云（山东省动物疫病预防与控制中心　山东 济南 250022）

猪流行性腹泻病毒分子结构、诊断技术和疫苗的研究进展

张 月王 敏胡莉萍李玉杰孔祥华曹振山姜秀云*（山东省动物疫病预防与控制中心山东 济南 250022）

猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，可以引起猪严重的腹泻与脱水，导致仔猪早期死亡的重要病原之一。该病毒首次在欧洲被发现，随后传播到许多亚洲国家。猪流行性腹泻已成为世界流行性疾病，给养猪业包括疫苗防疫和疫病诊断方面都造成了严重的经济损失。近几年来，随着该病毒分子机制了解的深入，加快了检测手段以及疫苗研制的研究步伐，使得大量有效的新疫苗问世。本文详细分析了猪流行性腹泻病毒分子结构和遗传特性，深入探讨了近期诊断技术和可行性疫苗等方面的研究进展，为该病的研究和预防提供参考。

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea，PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的以腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病［1］。PED于1971年在英国的养殖场首次出现，随后传遍整个欧洲大陆，以冬季零星爆发为主要特征，起初命名为流行病毒腹泻（EVD）。1978年，人们实验证实了CV777病毒株是引起仔猪与育肥猪肠道致病感染的病原后，该病又被重新命名为猪流行性腹泻（PED）［2］。PEDV具有与冠状病毒科冠状病毒属其他成员同样的形态结构。该病毒粒子是多形态的，大致呈球形，其平均直径（包括纤突）约130nm，范围为95～1990nm，但是它的内部结构仍然不清楚。病毒的抵抗力不强，对乙醚、氯仿等敏感，一般的消毒剂即可将其杀灭，在蔗糖中的浮力密度为1.18g/ml，病毒没有血凝性。PEDV主要结构蛋白包括：纤突蛋白（S）、膜蛋白（M）、核衣壳蛋白（N）和小包膜蛋白（E）。PEDV适应株经60℃或以上处理30min即可失去感染能力，但在50℃以及在4℃ pH 5.0～9.0及37℃ pH 6.5～7.5时相对稳定［3］。与其他冠状病毒相比，PEDV的人工细胞培养很难获得成功。最初病毒的培养是经口腔接种3至5日龄仔猪，然后收集腹泻早期的仔猪小肠及其内容物。后来，科学家成功将PEDV接种到Vero细胞并可以传代培养，但前提条件是在无血清的培养液中加入10～100µg/ml胰蛋白酶，细胞会产生空泡或者多核等是病变结构。

1　PEDV的分子结构和遗传特性

（1）PEDV是一种被膜病毒，它的基因组是单股正链具有感染性的RNA，全长约28Kb，两端带有帽子结构（Cap）和Poly（A）尾巴。基因组包含5′非编码区（UTR）、3′UTR和7个开放阅读框（ORF）。这7个ORF编码4个结构蛋白（S、E、M、N）和3个非结构蛋白（复制酶1a、复制酶1b 和ORF3），从5′～3′端依次为：复制多聚蛋白基因1a1b-S基因-ORF3基因-E基因-M基因-N基因［5，6］。（2）S蛋白是种Ⅰ型糖蛋白，由1383个氨基酸（aa）组成，分子量为150-220kDa。它包含一个信号肽区（1～18aa），四个中和位点区域（499-638aa、748-755aa、764-771aa和1368-1374aa），一个跨膜区（1334-1356aa）和一个较短的胞内区。根据冠状病毒S蛋白的同源性可以将其分为S1（1-789aa）和S2（790-1383）两个结构域。S蛋白位于病毒粒子的表面，当位于细胞表面上的受体与病毒粒子结合后，S蛋白就会通过膜融合方式侵入到宿主细胞内并在感染宿主体内介导产生中和抗体。除了在介导免疫方面的作用外，S蛋白还具有促进病毒与细胞膜的融合、识别靶细胞等其它生物学作用。此外，根据与病毒在体外培养适应增殖，体内培养毒力减弱这一特性，S蛋白成为研制防疫PEDV新型有效疫苗主要的目的蛋白。科学家们主要是通过S基因的结构来探究PEDV各病毒株之间的遗传关系，流行性病学以及基因突变和病毒功能等方面［7-9］。（3）M蛋白是病毒粒子被膜中含量最多的一种成份，由226个氨基酸组成，分子量为20～30kDa。M蛋白由3个结构域组成：暴露于病毒囊膜外短的糖基化N末端区、位于中间位置的α螺旋区以及处于病毒囊膜中大的C末端区［10］。M蛋白在病毒粒子的组装和出芽过程中具有重要作用，同时能够刺激机体产生免疫保护，另外M蛋白介导机体产生a-IFN，所以可以作为PEDV基因工程疫苗的候选基因［11-14］。（4）N蛋白是基础性的磷酸化的核衣壳蛋白，共由441个氨基酸组成，分子量为58kDa，在细胞质中与病毒的基因组RNA结合并相互缠绕形成螺旋状的核衣壳。高水平的抗N蛋白的抗体在早期感染PEDV的猪体内就能产生，同时由于冠状病毒的N蛋白保守性强［15］，所以N蛋白可以作为早期PEDV感染分子生物学诊断技术的目标之一［16］。N蛋白的抗原表位能够诱导机体产生特异性抗体，T细胞表位能诱导产生细胞免疫，从而诱发机体有效免疫应答［17］。（5）科学家已对大部分冠状病毒的结构蛋白做了深入的研究，但对于该病毒属的附属蛋白了解甚少，且这些附属蛋白在细胞培养过程中病毒的复制是非必须的。复制酶多聚蛋白ORF1a（12354nt）和ORF1b（8037nt）是一个多功能的非结构蛋白，位于5'UTR的下游，预测分子量为753kDa，与病毒基因子的复制相关［18］。ORF3蛋白是分子量为25.3kDa的非结构蛋白，与病毒的毒力密切相关［19］，通过比较致弱型和野生型毒株，发现致弱的毒株均有17个氨基酸的缺失，推测这些重要位点与病毒的病原性密切相关［20］。

2　诊断

（1）由于腹泻类疾病引起症状具有相似性，所以PED不能靠临床症状和组织病理学变化来诊断。目前用来诊断PEDV的技术包括免疫荧光、免疫组化、电镜法、酶联免疫吸附试验和RT-PCR等技术。（2）免疫电镜法由于设备的限制，不适合用于大规模的临床检测。可用已知的高免血清确定未知的病毒，也可用已知的PEDV诊断恢复期的猪血清。免疫荧光技术检测病料中的PEDV是应用较为广泛的可靠的特异性诊断方法。取病猪小肠作冰冻切片或小肠粘膜抹片，丙酮固定后，加入荧光抗体染色，充分水洗后直接封盖镜检，1～2h即可得出结果。（3）Ishikawa等在PEDV的S基因序列上设计了一对引物，成功地建立了诊断PEDV的粪便毒和细胞毒的RT-PCR法，用时8h，灵敏度达100 TCID50/ml［21］。韩国科学家建立的TGEV和PEDV的双重RT-PCR检测方法，灵敏度达10TCID50/ml。Kim等比较了原位杂交、免疫组化与RTPCR的3种实验方法，结果显示重复性最好的是RT-PCR法，但检测福尔马林固定的样品时，原位杂交和免疫组化的效果会更好［22］。由于RT-PCR法需要特殊的仪器设备，尽管具有较好的特异性和敏感性，但目前仍只能用于实验室检测，而不能用于临床诊断。（4）近期，以表达蛋白为基础来检测PEDV的ELISA法发明成功。在这项技术中，多克隆抗体是利用M基因进行原核表达从而用纯化好的M蛋白免疫兔子获得，然后利用间接免疫荧光技术通过PEDV-M的二抗检测肠道病毒中感染PEDV的细胞的存在［23］。具有可从粪便中直接检测PEDV抗原以及操作简便的优点。阻断ELISA和间接免疫荧光技术可以分别检测到感染7天或者10～13天PEDV的血清中抗体，且用于间接免疫荧光技术检测的血清样本要在出现腹泻症状2～3周内采集并检测。

3　疫苗

（1）依据PEDV基因组序列、递送方式和效力的差异，科学家们已经研制出不同类别的PEDV疫苗。由于欧洲没有因PEDV引起牲畜死亡而造成大规模的经济损失，所以研制疫苗的重心落在了亚洲地区。亚洲的许多国家因为PEDV的感染，新生仔猪死亡率逐年升高。CV777病毒株具有典型的PEDV基因组序列特征，我国科学家通过使PEDV CV777株适应Vero传代细胞，研制成功了PED细胞灭活苗，免疫7天后便开始产生抗体，到免疫15天时已可产生较高水平的抗体，该疫苗的实验室保护率达90%以上，区域性以及较大规模的生产场试验均能获得95%以上的总体保护率，其安全性达100%［24］。日本科学家Kweon等将分离到的野毒株P-5V适应于Vero细胞并连续传代至93代，然后接种妊娠母猪，结果表明疫苗大幅度的提高了母猪免疫应答水平，并且使新生仔猪能够抵抗PEDV的感染。韩国科学家利用DR13株PEDV制备的弱毒疫苗是其用于预防PEDV感染的口服疫苗，从新生仔猪的小肠内容物中分离得到的，在Vero细胞上进行连续传代至100代。研究表明，细胞弱毒苗的免疫途径口服免疫比注射免疫效果更好，可直接给仔猪口服疫苗进行主动免疫，从而达到有效预防PEDV感染的目的［25］。（2）近阶段，转基因植物疫苗和乳酸杆菌表达PEDV抗原研制的疫苗作为新兴产物越来越多的被杂志报道。将PEDV S基因转入到烟草中，然后提取转基因烟草蛋白给小鼠注射，通过血清蚀斑减数和中和测定证明转基因烟草蛋白具有免疫原性，小鼠直接服用这种转基因植物能够产生黏膜免疫和全身免疫。之后，人们还利用密码子优化技术和病毒表达系统将抗原基因转入到胡萝卜和莴苣中，饲喂小鼠转基因胡萝卜和转基因莴苣，从而达到免疫保护的功效［26］。这些研究为开发PEDV口服转基因植物疫苗提供了技术支持。转基因植物疫苗具有植物细胞的全能性，口服后能有效的诱导机体的黏膜免疫，因此具有广泛的应用前景。（3）乳酸杆菌是人体和动物体内的益生菌，能够诱导机体产生非特异性及特异性免疫应答，被广泛的应用于食品工业、饲料加工业等行业。以乳酸杆菌为载体来构建质粒，能够在机体黏膜中增殖，并可以持续不断的表达病原微生物的保护性抗原基因，为多功能黏膜免疫的微生态制剂疫苗提供了广阔的研究前景。科学家葛俊伟等利用PEDV的主要防治途径是黏膜免疫这一特性，初次探究了PEDV 乳酸杆菌基因工程疫苗。他们将含有PEDV N基因和中和抗原位点的重组质粒构建到干酪乳杆菌中，使其有效的表达保护性抗原基因产生的外源蛋白，外源蛋白经口服免疫，能够刺激小鼠肠道产生局部的粘膜免疫应答反应，还可诱导机体产生特异性免疫应答。结果显示具有良好免疫原性的重组干酪乳杆菌为PEDV口服疫苗的研制奠定了基础［27，28］。

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中图分类号：S858.28

文献标识码：A

文章编号：1007-1733（2015）01-0077-03

收稿日期：（2014-12-02）

*通讯作者