张佳娟　综述，李　平　审校

筛查献血者丙型肝炎病毒感染研究进展

张佳娟综述，李平审校

【摘要】丙型肝炎病毒（HCV）是一种单股正链RNA病毒，全长约9.6 kb，开放读框区编码结构蛋白和非结构蛋白。全球HCV感染率约为3%，是一种严重威胁人类健康的传染病，在献血者中进行HCV筛查是防控丙型肝炎病毒传播的最有效手段。目前，检测HCV感染的方法主要包括抗HCV抗体检测、HCV抗原检测、HCV抗原-抗体联合检测、胶体金法快速检测、HCV分子核酸检测等。抗体检测应用最早，但窗口期较长；抗原检测能缩短窗口期，敏感性高，但易受到体内因素的干扰而影响检测结果。一些快速检测方法不需要任何设备，且简便易行，但其敏感性较差。分子检测使用的HCV RNA扩增技术（NAT）是目前最敏感的检测技术，能大大缩短窗口期，但其检测成本较为昂贵。各检测方法各有其优缺点。目前，血液中心采用至少两种不同试剂检测抗HCV以进行血液的安全筛查。

【关键词】丙型肝炎病毒；输血后肝炎；核酸扩增试验；献血者

输血治疗是临床上抢救危重患者的重要手段之一，但在输血过程中存在传播疾病的风险。由于我国是病毒性肝炎的高发区，输血后肝炎（post-transfusion hepatitis，PTH）已成为现代输血领域的一个突出问题。在所有PTH中，90%都和丙型肝炎病毒（Heptitis C Virus，HCV）感染有关。随着医学检验的不断进步，HCV检测方法已有较大的发展，制定符合经济成本和安全保障需求的筛查方案，降低输血感染HCV风险是一项刻不容缓的任务。我国现阶段HCV抗体检测是国家血液筛查的强制标准，胶体金快速检测可作为初筛检测，HCV RNA核酸检测只在部分发达地区的血站试行，而HCV抗原检测尚未应用于血液筛查。本文就上述几种HCV检测技术进行综述，以加深对其认识。

1　HCV概述

1943年Beeson和Morgan最早报道了部分患者在输血后出现黄疸［1，2］。黄疸的出现引起学者对输血后感染以及PTH的重视和研究。乙型肝炎病毒（Heptitis B Virus，HBV）是最早发现和PTH相关的肝炎病毒，1971年美国政府规定在献血者中筛查乙肝表面抗原（HBsAg）［3］，但此后PTH仍时有发生，而其中大部分（约75%）都和HBV感染无关。1973年Feinstone et al发现了甲型肝炎病毒（Heptitis A Virus，HAV），随后的研究证明其并不通过输血感染［4］。1977年柳叶刀杂志上曾报道新的PTH病原体，但当时未能鉴定出是何种肝炎病毒，于是采用非甲非乙肝炎（non-A，non-B Heptitis，NANBH）这个概念［5］。直至1989年美国学者Choo采用分子生物学技术成功克隆了HCVcDNA，鉴定为新型肝炎病毒。HCV可通过输血感染，是PTH的另一主要病原体［6］。据世界卫生组织统计，全球HCV的感染率约为3%，每年新感染病例约315万例［7］，死亡25万例，占所有传染病死因的第10位。由于HCV RNA的变异性，短期内难以研制出特异性的丙型肝炎疫苗，预防HCV感染主要通过积极有效的措施来切断传播途径。不同国家报道献血者中HCV阳性率从0.4% 到13.3%不等［8～11］，在献血者中筛查HCV以防控输血感染尤为重要。

HCV属于黄病毒科，其基因组为单股正链RNA病毒，全长约9.6 Kb，包括5’非编码区、开放读框区和3’非编码区［12］。开放读框区编码长度约3000个氨基酸的蛋白前体，经宿主细胞基因和病毒基因编码的蛋白酶切割，成熟为结构蛋白和非结构蛋白。HCV基因组的5’端为结构蛋白的结构区，由C、E1和E2基因组成，分别编码核心蛋白、包膜蛋白gp33 （E1蛋白）和包膜蛋白gp70（E2蛋白）。核心蛋白含190个氨基酸，序列十分保守，在 HCV增殖及致病机制中起重要作用，是HCV感染的重要标志。E2蛋白的氨基端有一个高变区，可能是中和抗体作用的位点。HCV基因组的3’端为编码功能蛋白的非结构区，分别编码非结构蛋白NS2、NS3、NS4 和NS5。其中NS3蛋白具有蛋白酶功能，NS5蛋白为RNA依赖的RNA多聚酶，分为NS5A和NS5B。NS3、NS4和NS5均能有效的诱导HCV感染者出现抗体应答，其中NS3抗体出现最早，但由于其是构象依赖性的，使用NS3的合成多肽并不能检出相应的特异性抗体。而NS4区则含有至少两个免疫优势序列位点，抗原性较强，绝大多数HCV感染者能产生针对该区C100-3的抗体反应［13］。

2　血清HCV抗体检测

HCV抗体检测主要采用酶免疫分析（EIA）技术，先后已经历了三代技术发展。不同HCV抗体检测试剂分别针对HCV不同结构蛋白的不同表位而设计，1989年美国Chiron公司最早利用重组HCV抗原C100-3融合蛋白包被，建立了第一代HCV抗体检测方法。第一代方法通常在感染HCV 后12 w～26 w才能检测出抗体，存在一个较长的窗口期［14］。同时第一代方法只是根据非编码抗原NS4区域进行设计，其特异性差、灵敏度也较低。第二代HCV抗体检测试剂盒于1990年出现，它以HCV基因组非编码抗原NS3区的C33C 和NS4区的融合表达抗原（C200）再加上C区的核心抗原C22-3作为固相包被进行检测。第二代检测方法弥补了第一代方法的部分不足，提高了HCV检测的敏感性和特异性。研究显示，其在HCV感染高危人群中的检出率较第一代检测方法提高了5%～40%；在急性输血后HCV中，较第一代方法提高20%以上；而在慢性HCV感染者中的检出率也增加了10%以上；同时抗C33C较抗C100-3出现早30天～90天，可缩短窗口期至10周左右［15］。目前国内献血中心采用的HCV筛查方法，绝大部分用的都是第三代HCV抗体检测方法。第三代方法在第二代的基础上，还结合了另一个非编码抗原NS5，由于同时检测病毒基因组的结构区和非结构区的多个编码抗原，不但提高了检测的灵敏度和特异性，还使检测的窗口期又缩短了1周左右［16］。EIA检测抗体技术具有简便、快捷等特点，但易受到诸多因素的影响，如类风湿因子、高免疫球蛋白血症、标本中超氧化物歧化酶等因素可造成假阳性结果；而检测过程中加样时间过长、操作速度过快、洗板等因素可造成假阳性结果［17］。由于HCV感染到机体抗体产生有一个较长的时期，平均约40天～70天，称为感染后血清转阳前的窗口期。尽管第三代检测技术已将窗口期缩短至66天左右，但这仍然是威胁输血安全的重要因素之一。

3　血清HCV抗原检测

核心抗原蛋白（Core）的氨基酸序列在不同基因型的HCV氨基酸序列同源性超过95%，是HCV早期感染的重要标志。目前HCV抗原检测试剂盒主要检测HCV的核心抗原，对HCV核心抗原检测有利于HCV早期感染献血者的发现，特别是一些免疫功能紊乱、免疫功能低下的患者及某些不产生抗体的携带者。一项对18例HCV抗体阴性，HCV RNA阳性的患者研究发现，11人（61%）能够检测出HCV核心抗原阳性［18］。另一项研究发现6名HCV RNA阳性，HCV抗体阴性的献血者中，5例（83%）的献血者为HCV核心抗原阳性；在135例长期血液透析患者的血清标本中，有92例HCV RNA阳性，其中81例（88%）检测出核心抗原阳性［19］。目前认为HCV核心抗原检出的平均窗口期为49天，仅仅比HCV RNA晚1天～2天。HCV核心抗原阳性与HCV RNA检测结果之间存在一定的相关性，国内一项研究报道：在142例慢性丙型肝炎患者血清中，HCV核心抗原和HCV RNA阳性率分别为45.1%和43.0%，两种标志物均为阳性者58例，均为阴性者75例；HCV RNA阴性血清HCV核心抗原阳性6例，HCV RNA阳性血清HCV核心抗原阴性3例，结果符合率为93.7%（133/142），核心抗原检测和病毒检测的阳性率无统计学差异（P＞0.05）［20］。一项荟萃25篇文章的meta分析结果显示：HCV核心抗原检测的敏感性平均约84%（95%CI：0.83-0.85），而特异性可达到98%（95%CI：0.97-0.98）［21］。HCV抗原检测耗时短，方法与常规酶免疫实验相似，不用添加仪器设备，且大大缩短了窗口期。但是当机体出现HCV抗体之后，体内HCV核心抗原和抗体相结合，抗原检出率下降。因此，HCV核心抗原主要应用与HCV感染的早期诊断［22］。

4　血清HCV抗原-抗体联合检测

HCV抗原-抗体（HCV Ag/Ab）联合检测被认为是“第四代”检测技术，近年国内外已有多篇文献报道使用。该方法主要应用夹心酶免疫技术，在固相和第二层中包被了HCV衍生抗原和HCV抗体。Laperche et al［23］采用Monolisa HCV Ag/Ab联合检测对12份HCV RNA和HCV抗原检测均阳性、HCV抗体检测阴性的样本进行检测，其中有6份样本检测结果呈阳性。他们还对发生HCV抗体阳转的血液透析患者血清标本进行动态研究，在抗体阳转前采集的样本中，24 份HCV RNA阴性的样本Monolisa HCV Ag/Ab联合检测亦呈阴性，59份HCV RNA阳性的样本中有23份呈阳性；对于血清HCV抗体阳转后采集的83份样本中，Monolisa HCV Ag/Ab联合检测结果均呈阳性。Laperche et al随后对44份核酸检测呈阳性的窗口期标本进行检测，其中31（70.5%）能够使用Monolisa HCV Ag/Ab检测呈阳性。Monolisa HCVAg/Ab联合检测的窗口期平均为26.8天，平均比核酸检测晚5.1天，而联合检测的特异性能达到99.88%［24］。另一种联合检测试剂Murex HCV Ag/Ab同样具有较高的灵敏度和特异性，报道称其窗口期比HCV抗体检测方法早14.1天，更比Monolisa HCV Ag/Ab方法早2天左右［25］。

5　快速检测

胶体金法快速检测技术从1989年诞生至今，已被广泛应用于免疫检测的各个领域，这个方法可以在几分钟内完成检测，并且不需要依赖任何仪器和设备。HCV胶体金法快速检测技术主要采用特异性抗原抗体反应及免疫层析技术，对HCV的Core和NS3抗原进行标记和包被制备检测试剂。HCV不同来源的诊断抗原、抗原浓度比例和制备工艺都可能影响试剂的检测性能［26］。样本溶血会影响胶体金在硝基纤维膜上的层析过程而出现假阴性；非特异性的高IgG对固相载体具有较强的吸附力，可引起假阳性［27］。来自51个血液中心的检测结果显示：快速HCV抗体检测的敏感性范围是47% ～100%［28］。虽然临床使用中存在一定的假阳性和假阴性，但胶体金法快速检测仍可作为筛查HCV抗体的首推方法，对于早期发现预防和控制丙型肝炎具有重要的临床价值和应用［29］。

6　HCV分子核酸检测

HCV感染后基因组的复制出现较早，感染后数天即出现病毒血症，大约1～2周即可检测到HCV RNA。HCV RNA是HCV在机体内存在的最直接标志，对其检测可大大缩短窗口期。核酸扩增试验（nucleic acid amplification，NAT）是一系列直接检测病原体核酸的技术的总称，主要是使用一些物理、化学和生物学的方法，通过靶核酸扩增的方法，将极微量的核酸转变成直观的光电或可视信号，从而判断是否存在病原体［30］。NAT检测技术主要采用聚合酶链反应（PCR）和转录介导的扩增（TMA）两种原理。PCR过程需要先将RNA逆转录（RT）为cDNA，再进行DNA扩增；而TMA利用T7RNA聚合酶进行一系列反应，在等温条件下进行反转录以提高RNA水平到可检测的程度。NAT可检测出极微量的核酸，大大缩短窗口期，目前已有40多个国家的血液中心开始使用NAT技术在献血者中检测HCV，我国也逐步将NAT血液筛查纳入新的输血技术操作规程［31］。最初的NAT检测方法是混合样品检测（MP-NAT），即混合6-96个标本同时进行检测［32］，但是MP-NAT在降低成本的同时也大大降低了检测的敏感性，部分发达国家的血液中心开展单份样品检测（ID-NAT）以提高HCV检测的敏感性［33］。

NAT方法灵敏度可检测出载量为2.0IU/ml～9.4IU/ml水平的HCV RNA［34］，同时可缩短窗口期至4天～6天，此外，它还可以检测出免疫静止期携带者体内的病毒。当NAT筛查方法用于输血前筛查后，输血感染HCV的风险进一步显著下降。美国于1999年开始使用NAT技术在献血者中筛查HCV，在此之后的10年间6600万HCV抗体阴性的献血者中，NAT检测方法共筛查出244例献血者HCV阳性，与1999年相比，2008年的献血者中HCV流行率下降了53%［35］。德国在1990年至1998年间，每年大约有7起输血感染HCV病例发生，但在使用NAT检测后，几乎没有新增病例的报道［36］。NAT技术以其高敏感性和特异性已得到广泛应用，但是仍存在一些抗体阳性，NAT检测阴性的报道，国内有学者对47004份无偿献血者标本进行检测比较，ELISA检测到的HCV抗体阳性样本总数共245份，而NAT检测HCV RNA阳性结果为12份，最终确定15份为HCV阳性［37］。另外，NAT技术对仪器、设备以及人员培训均有较高的要求，在部分欠发达国家和地区推广使用受到限制。

7　结语

临床输血的风险最小化和利益最大化需要血液中心提供充足和安全的血液，“零容忍”是人们对输血风险的态度。随着检测技术的发展，输血风险不断降低，但各检测试剂仍有其优缺点，尚不能以某一种方法代替其他方法。ELISA抗体检测虽然价格便宜，但窗口期较长；HCV核心抗原检测操作易行，敏感性高，费用低廉，但易受到体内抗体的影响。快速检测简便、易行，但其敏感性较差。NAT检测在现阶段提供了最安全的保障，但其昂贵的价格制约了全面推广。因此，各检查技术应相互结合，发挥各自的优势，以降低输血感染HCV的风险，保障血液安全。

我国从1998年开始在献血者中全面采用两种试剂检测HCV抗体，但单纯抗体检测存在一定的假阴性和假阳性。最新的《血站技术操作规程（2012版）》建议：采用2个不同生产厂家的ELISA试剂检测HCV抗体或联合检测HCV抗原和抗体；或者采用1种ELISA试剂检测HCV抗体或联合检测HCV抗原和抗体，采用1种试剂检测HCV核酸。我国目前仍处于发展中国家，各地区应根据经济发展特点，结合献血人群HCV流行病学分布，调整HCV筛查策略，制定安全可靠、符合经济成本的血液筛查方案。

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（收稿：2014-05-23）

（本文编辑：张骏飞）

第一作者：张佳娟 ，女，32岁，大学专科，护师。主要从事血液检验和采集工作。E-mail：leep2002@163.com

DOI：10.3969/j.issn.1672-5069.2015.01.031

作者单位210003南京市 红十字血液中心（张佳娟）；解放军第81医院（李平）

Screening tests for hepatitis C virus infection in blood donors:does it safe or not？ Zhang Jiajuan，Li Ping.Department of Physical examination and Blood Branch，Blood Center，Red Cross，Nanjing 210003，China

【Abstract】Hepatitis C virus（HCV）is a single-stranded RNA virus that is about 9.6 kb.Its open reading frames encoding structural proteins and non-structural proteins.HCV infection is approximately 3%worldwide.It is one of the most serious infection diseases that threaten human health.Screening tests in blood donors is the most effective means to prevent the communication of HCV.The current methods for screening tests include detection of HCV antigen，anti-HCV antibody，HCV antigen-antibody complex，and HCV genes.Antigen detection is the initial screening test and it detects seroconversion after a long infectious window period.The detection of HCV core antigen might shorten the window period and has a high sensitivity，but interference by immunoglobulins in vivo influence its widespread uses.Rapid tests is simple to perform，but its sensitivity is low.Molecular testing for HCV RNA utilizing nucleic acid amplification technology（NAT）is the most sensitive assay and can shorten the window period，while the costs is very expensive.Each screening tests for HCV infection has its advantages and disadvantages.Currently，the blood centers are using at least two different reagents to detect HCV antibodies for blood screening.

【Key words】Hepatitis C virus；Post-transfusion hepatitis；nucleic acid amplification technology；Blood donors