王庐宇，朱长军

（天津师范大学生命科学学院，天津300387）

驱动蛋白Kif18A多克隆抗体的制备、纯化及免疫特异性检测

王庐宇，朱长军

（天津师范大学生命科学学院，天津300387）

采用标签蛋白诱导表达纯化、蛋白质谱、Western Blot、免疫荧光染色等多种分子生物学与细胞生物学方法，探究了一种制备蛋白特异性多克隆抗体、检测抗体并且运用抗体获得蛋白翻译后修饰信息的实验思路.结果表明，使用这种方法可以高效地得到Kif18A的兔源多克隆抗体.得到的抗体血清可以很好地应用于Western Blot（蛋白免疫印迹）、Co－IP（免疫共沉淀）等分子生物学实验.将抗体血清纯化后可以应用于免疫荧光染色实验，并可以获得良好清晰的实验结果.此外，利用制备出的Kif18A特异性抗体对细胞内源性Kif18A进行Co－IP实验后进行质谱分析，得到了内源性Kif18A蛋白翻译后的修饰信息，为研究Kif18A蛋白的定位与功能奠定了良好的基础.

驱动蛋白Kif18A；多克隆抗体；蛋白质谱；蛋白磷酸化

在已知的40余种驱动蛋白（kinesin）分子中，Kif18A蛋白近年来受到了越来越多的关注.在先前的文献中报道，Kif18A蛋白分子在体外实验中证实具有微管解聚活性.这不同于早期报道中典型的驱动蛋白分子的特性.先前认为驱动蛋白家族分子中有些具有微管解聚酶功能（如Kif2C，即MCAK蛋白），有些可以沿细胞骨架运动（如Kif5A）.但是，像Kif18A蛋白这样两种功能兼具的分子还比较罕见［1］.近年来国际上关于该蛋白分子的文献报道数量达到数十篇，其中最为引人关注的焦点在于Kif18A蛋白对于细胞分裂进程的正常进行以及纺锤体功能和形态的影响起到了至关重要的作用.尤其是Kif18A蛋白在有丝分裂前中期对于染色体正确排列的重要意义以及Kif18A与细胞纺锤体中期检验点的密切关系更是成了最近5年的研究热点.此外，Kif18A蛋白在某些肿瘤的发生、发展或迁移的过程中都发挥到了相应的作用［2－7］.为了能够通过细胞内或细胞外实验对该蛋白分子进行深入的研究，必须要得到纯度和效价都极高的特异性Kif18A蛋白抗体，为此，本文设计了制备Kif18A特异性抗体的实验，以满足实验室对于该蛋白分子在细胞和分子生物学层面的研究需要.

1 实验材料与方法

1.1材料

人宫颈癌细胞HeLa，本实验室自存；pEGFP－Kif18A（C297）质粒为本实验室先前构建；pGEX－KG载体、pET28a载体为本实验室自存.感受态大肠杆菌（E.coli）复制菌株Top10、表达菌株BL21购自TransGen公司.DNA限制性内切酶EcoRI和SalI以及T4DNA连接酶购自Thermo公司；λ－HindⅢdigest DNA Marker购自TaKaRa公司.其他试剂为进口原装、分装或国产分析纯.DNA测序工作委托金唯智公司进行，蛋白质谱分析工作委托军事医学科学院国家生物医学分析中心进行.

1.2 GST与His标签融合蛋白表达质粒的制备

驱动蛋白8家族分子靠近C端部分包含多个结合功能域且暴露在外，为了得到特异性Kif8A的抗体，实验中设计采用Kif18A蛋白分子C端297个氨基酸的区段作为抗原，免疫后得到该蛋白分子的多克隆抗体.前期，本实验室已制备出pEGFP－Kif18A（C297）的真核表达质粒，本实验使用限制性内切酶EcoRI和SalI将该质粒在37℃条件下双酶切2h，同时将pGEX－KG载体质粒与pET28a载体质粒37℃条件下双酶切2h.随后在1%琼脂糖（BIOWEST）凝胶中进行电泳，将酶切后的目的基因条带切下，使用AXYGEN公司的AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒将目的基因进行回收.使用T4DNA连接酶在16℃条件下将目的基因与载体连接过夜，从而构建出pGEX－KG－Kif18A（C297）（简称GST－KC297）与pET28a－Kif18A（C297）（简称His－KC297）质粒，二者在原核表达体系中分别表达GST蛋白标签融合蛋白或His标签融合蛋白.

1.3 GST与His标签融合蛋白的表达

将构建得到的原核表达质粒GST－KC297与His－KC297转化入感受态大肠杆菌复制菌种Top10，挑选阳性单克隆，37℃条件下200r／min培养过夜.使用QIAGEN公司的DNA提取试剂盒QIAprep Spin Miniprep Kit（250）提纯质粒，通过酶切和DNA测序进行鉴定.将提纯、鉴定后的原核表达质粒GST－KC297与His－KC297转化入感受态大肠杆菌表达菌种BL21，利用IPTG诱导融合蛋白表达，离心收集细菌沉淀进行后续实验.

1.4可溶性蛋白抗原的纯化

使用L－buffer（5mg／mL Lysozyme，100mmol／L pH＝8.0Tris－Cl，5mmol／L EDTA，20mmol／L β－ME）溶菌后使用T－buffer（2%Triton X－100，50mmol／L pH＝7.5Tris－Cl，150mmol／L NaCl，10mmol／L EDTA，1mmol／L EGTA，1%甘油，2.5mmol／L DTT，1mmol／L PMSF，10μg／mL leupeptin）裂解细菌，随后使用超声破碎仪把细菌彻底裂解.将Glutathione Sepharose（GE）与细菌裂解液在4℃条件下充分摇匀12h，使细菌中表达的GST－KC297蛋白与Glutathione Sepharose珠子充分结合.随后使用E－buffer（100mmol／L pH＝8.0Tris－Cl，5mmol／L EDTA，20mmol／L GSH，20mmol／L β－ME）洗脱GST－KC297蛋白，并使用500～1 000倍洗脱液体积的PBS在4℃条件下透析12h，以除去E－buffer中的谷胱甘肽和洗脱液中其他的有毒成分.

1.5不可溶蛋白的纯化与抗原－树脂凝胶的制备

将实验中细菌诱导表达的His－KC297采用SDS－buffer（含有2%SDS的PBS缓冲液）裂解，用与裂解液等体积的Triton buffer（含有8%Triton X－100的PBS缓冲液）中和，随后与Ni－NTA Resin（BIO BASIC INC.）在室温条件下充分混合摇匀4h，使His－KC297特异性地结合到树脂珠子上.使用DMB将珠子与His－KC297蛋白进行共价交联，并使用乙醇胺（0.2mol／L，pH＝8.0）中和，得到抗原－树脂交联珠子.

1.6抗体血清的纯化

使用饱和（NH4）2SO4将血清中免疫球蛋白沉淀，利用1／3血清体积的TBS重悬沉淀的蛋白，随后使用500倍重悬液体积的TBS在4℃条件下透析12h，以除去残留的（NH4）2SO4.把透析后的免疫球蛋白（抗体主要为IgG）重悬液与先前实验中得到的抗原（His－KC297）－树脂（Ni－NTA）交联珠子在4℃条件下充分结合，并采用甘氨酸溶液洗脱（0.1mol／L，pH＝2.5）.洗脱后与1／10洗脱液体积的Tris－Cl缓冲液（1mol／L，pH＝8.0）混合使抗体溶液呈中性，并贮存于4℃冰箱中.

1.7细胞培养与质粒转染

将人子宫颈癌细胞HeLa用含有10%胎牛血清（HyClone）的DMEM／High Glucose细胞培养基（HyClone）在37℃含5%CO2的细胞培养箱中培养；进行质粒转染实验前在24孔板内每孔接种30 000～50 000个细胞，接种24h后待细胞附着到皿壁或细胞爬片后进行质粒再转染.细胞转染实验在500μL体系中进行，使用TurboFect（thermo scientific）作为转染试剂.每500μL体系中使用1μLTurboFect，200ng质粒；在免疫共沉淀（IP）实验中使用直径15cm的平皿培养细胞；在进行细胞周期同步化时，加入50nmol／L Taxol或80ng／mL Nocodazole，20h后收集细胞进行后续实验.

1.8免疫荧光染色与免疫共沉淀

免疫荧光染色实验采用福尔马林固定液（含有3%甲醛，2%蔗糖的PBS缓冲液）固定15min，采用山羊血清封闭液（含有10%山羊血清，0.4%Triton X－100的PBS缓冲液）封闭0.5h.二抗为FITC或Texas Red标记的羊源二抗，采用DAPI染色DNA.一抗室温孵育2h，二抗室温避光孵育1h，DAPI室温避光孵育3min.免疫共沉淀实验采用NP－40buffer（1%NP－40，50mmol／L pH＝7.5Tris－Cl，150mmol／L NaCl，1%甘油，2.5mmol／L DTT，1mmol／L PMSF，10μg／mL Leupeptin，2μg／mL Aprotinin，50mmol／L Na3VO4，5mmol／L NaF）冰浴裂解细胞1h，裂解后在4℃条件下14 000r／min离心10min；取上清加入Kif18A抗体血清后4℃条件下摇匀4h，随后加入Protein A－Agarose（Roche），4℃条件下摇8h.随后用NP－40buffer清洗3遍珠子，使用SDS sample buffer（2%SDS，50mmol／L pH＝6.8Tris－Cl，10%甘油，20%β－ME）裂解珠子上结合的蛋白.将裂解液进行蛋白电泳，电泳后进行考马斯亮蓝染色或进行Western Blot实验.

2 实验结果

2.1 GST－KC297与His－KC297原核表达质粒的构建

本实验室在前期已经构建出以GFP为标签的融合蛋白质粒pEGFP－Kif18A（C297），该质粒为在载体质粒的GFP基因C端后插入了一个可表达Kif18A蛋白C端297个氨基酸残基的Kif18A基因片段.在该质粒的Kif18A（C297）基因片段的两端存在限制性内切酶EcoRI和SalI的酶切序列，故本实验首先对于GFP－Kif18A（C297）质粒进行了酶切鉴定和DNA测序鉴定.如图1A所示，经EcoRI和SalI双酶切后确实得到了一个基因片段，同时DNA测序结果显示，该质粒确认无误.将回收后的基因插入到本实验室所有的带有GST蛋白标签基因的pGEX－KG载体质粒中以及带有8个His蛋白标签基因的pET28a载体质粒中.质粒构建后进行酶切鉴定（如图1B所示）与DNA测序鉴定验证.

2.2 GST－KC297抗原蛋白的纯化

将诱导、表达GST－KC297蛋白的细菌沉淀，利用T－buffer裂解后溶菌产物的上清即可获得大量的GST－KC297蛋白.将300mL细菌培养液离心收集后，裂解于30mL体系中，裂解后离心弃去沉淀，在上清液中取出10μL进行SDS－PAGE蛋白电泳，采用考马斯亮蓝R－250染色后（见图2A），可见经IPTG诱导后的GST－KC297蛋白的大量表达.使用1.4的方法纯化GST蛋白后洗脱于2mL体系中，取出10μL洗脱液进行SDS－PAGE蛋白电泳，采用考马斯亮蓝－250染色（见图2B）进行验证.使用BCA法测量蛋白浓度后，－80℃保存.

2.3 His－KC297蛋白与Ni树脂凝胶的交联

采用本文1.5中的方法，在200mL体系中使用BL21菌株表达His－KC297蛋白，经IPTG诱导表达后，使用SDS buffer裂解细菌.随后加入1mL Ni树脂凝胶珠子与His－KC297，使其充分结合并交联.实验中可见经DMB交联后的抗原－凝胶复合体不可被SDS裂解，在全部SDS－PAGE过程中His－KC297蛋白也不能从凝胶珠子上分离下来.

2.4抗原的免疫与抗体纯化

第一次抗原免疫使用1mL弗氏完全佐剂与100μg纯化后的抗原蛋白（以PBS补至2mL），充分混匀后皮下注射免疫雄性新西兰大白兔.随后的3周每周对该大白兔进行一次抗原的注射（采用弗氏不完全佐剂）.从第4周开始经兔耳缘静脉抽取免疫后的血清10～15mL，将血液在4℃条件下静置48h，14 000r／min离心后取上清，即为抗体血清.第5周继续注射抗原加强免疫，以此类推，隔周注射抗原，隔周抽血，持续6个月.经HeLa细胞Co－IP的实验检测可知，实验从第4周开始（前4周未知）得到的免疫血清中相对免疫前血清在Western Blot中出现了比较明显的特异性条带（相对分子质量为100 000附近）；随后得到的几次抗体血清中的信号强度不断增加，到免疫第8周以后血清的抗体特异性逐渐稳定并持续较高的效价约3个月.故本文中提及的Kif18A特异性免疫血清即为实验中得到的第8周至第30周的抗体血清.将第8周至第30周的抗体血清合并后进行后续的抗体纯化实验.

2.5抗体血清与纯化抗体的检测

如图3A所示，利用本实验中获得的Kif18A特异性免疫兔血清作为抗体，使用HeLa细胞全细胞裂解液进行Western Blot实验，可见在相对分子质量为100 000的位置附近有一条特异性免疫条带.使用Kif18A特异性siRNA处理细胞20h后该特异性条带消失，从而证实抗体血清确实对于Kif18A蛋白具有优良的特异性.如图3B所示，选取20mL Kif18A特异性抗体血清，使用1.7中的方法纯化后，经过1∶100倍比稀释后使用正常培养的HeLa细胞进行免疫荧光染色实验，绿色为微管染色、红色为Kif18A、蓝色为DNA.本实验中的Kif18A染色定位与文献中的报道完全一致.可以证实，该实验中得到的抗体不仅可以进行蛋白免疫印迹实验还可以进行免疫荧光染色实验.

2.6驱动蛋白Kif18A的翻译后蛋白修饰位点的检测

在上述实验中发现，正常传代培养的HeLa细胞中Kif18A蛋白的表达丰度比较低.以前有研究报道，Kif18A分子在有丝分裂期大量表达，伴随有丝分裂后期的到来，由于APC复合物的激活，Kif18A随即大量降解［8］.故本文中的某些实验采用了细胞周期同步化的方法以便获得含有Kif18A分子较多的有丝分裂前、中期的细胞.但是细胞周期同步化处理以后，在进行Western Blot实验时意外发现不仅Kif18A的条带荧光信号大幅增强，伴随而来的还有新条带的产生（见图4A），因此推测Kif18A分子可能在有丝分裂期大量表达后还出现了蛋白的翻译后修饰现象（如脲甲基化、磷酸化、乙酰化等）.故本实验通过IP的方法将用Taxol同步化处理的Kif18A蛋白与抗体共沉淀后进行蛋白电泳.利用考马斯亮蓝（R－250）染色后，切下Kif18A蛋白的条带，委托质谱分析，结果显示Kif18A蛋白分子的确在许多区域都显示有蛋白的表达后修饰现象发生（见图4B），图4B中列出了质谱分值最高的15个蛋白修饰.

3 讨论

通过本实验中介绍的方法获得的特异性Kif18A蛋白抗体血清与纯化后的特异性Kif18A蛋白抗体在分子生物学以及细胞生物学实验中都能比较好地发挥其功能.由于抗体血清在纯化的过程中会伴随着抗体效价的降低，但是为了获得纯度较高的抗体又必须将抗体血清中的杂质去除.基于上述两种考虑并结合实验的实际情况，一般认为，抗体血清较为适合进行Western Blot等实验.因为在SDS存在的体系中，蛋白分子的高级构象已经丧失，所以蛋白分子将暴露出比存在高级构象的分子更多的免疫结合位点.在此情况下，虽然抗体血清的纯化程度不高，但是也可以获得非常好的免疫效果.相反，如利用纯化的抗体进行Western Blot等实验时，虽然抗体纯化程度高，但是由于抗体效价的降低会造成抗体的过多浪费，同时也不会获得好的实验结果；在进行免疫荧光染色或免疫共沉淀实验时，由于抗原蛋白分子还维持一定的高级构象，导致抗原分子暴露出的免疫位点较少.所以，如若采用抗体血清进行免疫杂交，会导致实验结果的背景升高，从而影响结果的清晰度.一般认为在进行该类实验时采用纯化后的抗体能够得到较为清晰的实验结果.

虽然本实验中通过蛋白质谱的方法检测到了Kif18A存在多种蛋白修饰的可能性，但是主要的蛋白翻译后修饰是哪一种，发生在哪个具体的氨基酸位点，尚有待深入研究.另外，在Kif18A发生蛋白修饰后其功能和定位会发生什么样的改变也尚不清楚.并且，在统计质谱分析结果时发现，Kif18A的尾部（tail）区域存在大量的疑似蛋白修饰位点［9］.这与先前报道的驱动蛋白8家族成员（特别是Kip3与Kif18A）尾部区域存在重要功能的结果相符合［10］，也预示着Kif18A蛋白的尾部区域可能对于蛋白功能的发挥起到了非常重要的调控作用.

本文着重介绍了Kif18A蛋白分子的抗体制备与纯化方法.实验中得到的Kif18A特异性抗体在抗体检测实验中体现了较为优良的品质，为后续深入研究该蛋白分子打下了坚实的基础；此外，本实验中Kif18A蛋白修饰的发现与检测对后续实验也起到了重要的指导作用.

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Preparation，purification and specificity determination of kinesin－8family member Kif18Apolyclonal antibody

WANG Lu－yu，ZHU Chang－jun
（College of Life Sciences，Tianjin Normal University，Tianjin 300387，China）

To investigate the post－translational modification of Kif18Aby mass spectrometry，first performed expriment to prepare antibody against Kif18Aby injection of purified GST－Kif18protein into rabbit.By using affinity purification with Ni－NTA Agarose beads from rabbit serum，we got purified antibody，which has good quality of application in wester blot and immuniprecipitation.Thus provides a good oppertunity to further investigate the fuction of post－translational modification of Kif18A.

Kif18A；polyclonal antibody；mass spectrometry；protein phosphorylation

Q 291 ［学科代码］ 180·21 ［

］ A

（责任编辑：方林）

1000－1832（2015）01－0129－06

10.16163／j.cnki.22－1123／n.2015.01.024

2013－11－24

国家自然科学基金面上项目（31271485）；国家自然科学基金青年基金资助项目（31301138）；2011年教育部“新世纪优秀人才支持计划”资助项目（NCET－11－1066）；天津市应用基础与前沿技术研究计划重点项目（12JC2DJC21400）.

王庐宇（1987—），男，硕士研究生；通讯作者：朱长军（1972—），男，博士，教授，主要从事细胞分子生物学研究.