由继红，陆静梅，费虹天

（东北师范大学生命科学学院，吉林长春130024）

前红松和红松的系统比较研究

由继红，陆静梅，费虹天

（东北师范大学生命科学学院，吉林长春130024）

从结构植物学、植物生物化学、分子生物学三个方面对红松和前红松进行了系统的比较研究.结果表明：前红松叶的角质层内表面的胞间凸缘为浅波浪状，缘厚；红松叶的角质层内表面的胞间凸缘为深波浪状，缘窄.过氧化物同工酶电泳结果可见，前红松有8条酶带，红松有7条酶带；前红松的酯酶同工酶电泳有6条酶带，红松的酯酶同工酶电泳有5条酶带.前红松与红松叶绿体基因组中的rbcL基因片段458个核苷酸中有5个不同.

前红松；红松；角质层；过氧化物同工酶；酯酶同工酶；叶绿体基因rbcL

红松（Pinus koraiensis Sieb.et Zucc.）是松属中一个古老的树种，天然分布中心在中国的小兴安岭和长白山林区，俄罗斯东南部、朝鲜北部和日本本州中部山地也有部分分布［1］.前红松（Pinus prokoraiensis Y.T.Zhao，J.M.Lu，et A.G.Gu.）是松属中一个新种，也是一个珍稀树种，现仅存于中国吉林铁路局的土门岭林场，它具有生长快、抗盐碱性强等优点［2－3］.

前红松与红松形态相似，极易混淆，为了澄清其区别，陆静梅等研究了前红松和红松茎、叶解剖结构上的差别［4－7］.但有关前红松和红松叶的角质层、生理生化及分子生物学，特别是基因的核苷酸序列方面的研究未见报道.本文从这几方面对二者进行了系统的比较研究，以为前红松与红松的区别提供新的依据.

1 材料和方法

1.1实验材料

红松取自吉林省辉南县三角龙湾，地理位置为东经126°24′、北纬42°26′，海拔833m；前红松取自吉林省土门岭林场，地理位置为东经126°02′、北纬44°06′，海拔260m.

1.2实验方法

1.2.1 叶角质层内表面的观察

取胸径为20cm的前红松与红松的成熟叶片制备角质层样品［8］.角质层经不同浓度的乙醇脱水、干燥后，内表面向上粘在样品台上；IB－3离子溅射仪镀20nm厚的金膜.用日本产S－570型扫描电子显微镜观察并照相，电压20kV.

1.2.2 同工酶电泳

采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳法.各选5株植株，10年树龄，选取位置、叶龄相同的幼叶，用0.05mmol／L pH＝7.5的磷酸缓冲液冰浴研磨，于4℃条件下，11 000r／min离心20min，取上清液用于实验.过氧化物酶同工酶电泳的浓缩胶浓度为3.5%，分离胶浓度为6.5%，用联苯胺法染色［9］；酯酶同工酶电泳所用浓缩胶浓度为3.6%，分离胶浓度为7.5%，参照文献［10］的方法进行染色.用过硫酸铵

诱导凝胶聚合，Tris－甘氨酸缓冲液作为电极缓冲液.电泳各重复3次.酶带的迁移率＝分离胶起点到酶

带中心的距离／分离胶起点到前沿指示剂中心的距离.

1.2.3 分子生物学实验

取嫩叶用CTAB法提取总DNA.通过PCR反应扩增基因片段.20μL反应混合液中含有：DNA模板50ng，200μmol／L dNTP，引物各0.5μmol／L，TaqDNA酶1U.PCR反应在GeneAmp PCR System 9600反应仪（美国）上进行.扩增产物用ABI 373DNA测序仪进行测序.

扩增rbcL基因片段所用引物及反应条件：引物：F：5′－CAG CAG CTA GTT CAG GAC TC－3′；R：5′－ACA ATG GCC TAC TTC TTC AC－3′.反应条件：变性：94℃，3min.退火：94℃，50s；58℃，50s；72℃，80s，30个循环.延伸：72℃，5min.

2 结果与分析

2.1叶角质层结构

前红松和红松叶的角质层内表面的电子显微镜结构见图1.前红松角质层的胞间凸缘厚，浅波浪状，表面的突起小、少，内表面的细条纹状雕纹连成网状；红松角质层的胞间凸缘薄，深波浪状，表面的突起大、多，无细条纹状雕纹.

2.2过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶电泳结果

5株前红松相同部位幼叶的同工酶电泳结果表明，无论是过氧化物酶、还是酯酶，不同植株间无差异；5株红松幼叶的实验结果也是如此.过氧化物酶同工酶电泳结果如图2所示，前红松有8条酶带，红松有7条酶带.二者的同工酶谱带可分为3个区.Ⅰ区：红松有4条酶带，前红松有5条酶带；Ⅱ区：红松与前红松都有2条酶带；Ⅲ区：前红松、红松各有1条酶带.

前红松与红松的酯酶同工酶电泳结果见图3.由图3可见，前红松有6条酶带，红松有5条酶带.Ⅰ区：前红松和红松各有1条酶带；Ⅱ区：前红松有4条酶带，红松有3条酶带；Ⅲ区：前红松和红松各有1条酶带.

2.3分子生物学实验结果

随机取5株红松和前红松个体，分别测定其rbcL基因片段的核苷酸序列，结果见图4.结果表明，同种个体间rbcL基因片段的核苷酸序列无差别，但前红松和红松间有差别，458个核苷酸中有5个不同.

3 讨论

区别形态特征相似的植物，从传统的角度来研究主要是根据花、叶、茎、果实、种子等外部形态特征上的差异，像本文所采用的将植物解剖学、生理及生物化学和分子生物学等技术结合，从不同层次、不同角度来系统比较研究的方法尚没有见过报道.

角质层最早在甘蓝叶上证实存在［11］.它位于植物表皮细胞外壁的外面，多数植物角质层的表面平滑，但也有具有褶状或脊状条纹的角质层.角质层能够降低植物体内水分的蒸发，保护植物不被微生物等侵染，重要的是它还被应用于植物分类学的研究中.人们不但用光学显微镜对角质层的表面结构进行了大量研究，而且，还采用电子显微镜对角质层的内表面做了许多探讨.通过角质层对许多不同植物类群进行分类学等的研究，植物叶角质层的特征在古植物学和分类学中的价值已得到普遍认同［12－13］，角质层是个体鉴定可靠的指标［14－15］.

研究表明，松科9个属的叶角质层内表面的胞间凸缘和雕纹在属下分类上有重要意义［16］；冷杉属植物叶角质层内表面的胞间凸缘特征差异显著［17］.用电子显微镜对松属针叶角质层内表面的结构进行观察，可发现不同种胞间凸缘的特征差异显著［18］.本实验结果显示，前红松与红松的角质层内表面的胞间凸缘有明显区别，在颗粒状突起以及条状雕纹方面也存在差异.

同工酶广义来讲是指生物体内催化相同反应但其结构及物理化学性质不同的一组酶.同工酶的发现和分析方法的改进，使其广泛应用于分类学等学科中.当植物种依据形态特征难以区分时，往往多采用同工酶的方法.过氧化物酶同工酶和酯酶同工酶是在分类学中应用最多的酶.过氧化物酶是活性较高的一种氧化酶，是由一个铁卟啉辅基和单一肽链相结合而构成的血红素蛋白，其对过氧化氢具有专一性.该酶广泛存在于植物体中，具有多种功能，参与植物体内多种代谢过程，与植物的抗性密切相关，在活性氧代谢过程中具有重要作用.酯酶是催化酯类化合物水解的酶，它催化水解物质的酯键、酰胺键和硫酯键，参与植物体内的多种代谢反应，如磷的代谢、细胞壁的合成等.大量研究表明，过氧化物酶和酯酶能够用来区别不同的植物种［19－20］.我们的实验结果显示，前红松与红松的过氧化物酶同工酶电泳酶谱及酯酶酶谱在同工酶带数及迁移率方面明显不同，反映了前红松与红松在同工酶方面存在着差异.

分子生物学认为，生物千差万别的根本区别在于蛋白质的氨基酸顺序，其信息储存于DNA的序列中［21］.对基因序列的比较研究能够为系统学的研究提供直接和有力的证据［22］.

叶绿体DNA很保守，倒置重复区更加保守［23］，所以，人们对叶绿体DNA进行了许多研究［24］.其中，有关叶绿体基因组中的rbcL基因研究的最多，已被应用于系统学研究中［25］.rbcL基因是编码核酮糖－1，5－二磷酸羧化酶／加氧酶大亚基的基因，由叶绿体基因组编码，特别适合植物系统学研究［26］.核酮糖－1，5－二磷酸羧化酶／加氧酶是植物光合作用C3途径中固定二氧化碳的关键酶，也是植物光呼吸反应过程的关键酶，由8个大亚基和8个小亚基组成，对提高植物的光合作用效率有重要意义.用rbcL基因对马尾树科［27］、木兰亚纲［28］、松科［29］、芍药［30］等做的系统学研究，所得结果很好地解决了经典分类的相关问题.

本文分别对前红松与红松的rbcL基因进行了测序、比较，结果表明前红松与红松的该基因序列存在差异.

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A systematic comparative study of P.prokoraiensis Y.T.Zhao，J.M.Lu et A.G.Gu and P.koraiensis Sieb.et Zucc.

YOU Ji－hong，LU Jing－mei，FEI Hong－tian

（School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China）

Systematic comparative studied on P.prokoraiensis and P.koraiensis from three aspect of structural botany，plant biological chemistry and molecular biology in this paper.Those results：the intercellular flanges of the needle cuticle of P.prokoraiensis is shallow undulate and developed single flange，P.koraiensis’s intercellular flanges is deep undulate and not prosperous single flange.The electrophoresis of peroxidase isozyme in P.prokoraiensis was 8isozyme bands，P.koraiensis’s electrophoresis was 7isozyme bands.The electrophoresis of esterase isozyme in P.prokoraiensis was 6isozyme bands，P.koraiensis’s electrophoresis was 5isozyme bands.The nucleotide sequences for rbcL gene are different between P.koraiensis and P.prokoraiensis by 5nucleotides in a 458bp fragment.These results afford new gist for different of P.koraiensis and P.prokoraiensis.

Pinus koraiensis Sieb.et Zucc.；P.prokoraiensis Y.T.Zhao，J.M.Lu et A.G.Gu；cuticle；peroxidase isozyme；esterase isozyme；chloroplast rbcL gene

Q 944.53 ［学科代码］ 180·5130 ［

］ A

（责任编辑：方林）

1000－1832（2015）01－0119－05

10.16163／j.cnki.22－1123／n.2015.01.022

2014－05－07

国家自然科学基金资助项目（41271231）；吉林省科技发展计划项目（20120270）.

由继红（1965—），男，博士，高级工程师，主要从事结构植物学研究.