张春雨，李 凡，时东方，王雨萌，刘东波，夏红梅，陈 珊

（1.东北师范大学生命科学学院，吉林长春130024；2.长春师范大学中心实验室，吉林长春130032）

利用假单胞菌DS1001a降解聚3－羟基丁酸酯制备3－羟基丁酸

张春雨1，李 凡1，时东方2，王雨萌2，刘东波1，夏红梅1，陈 珊1

（1.东北师范大学生命科学学院，吉林长春130024；2.长春师范大学中心实验室，吉林长春130032）

利用单因素法和响应面中心试验法对假单胞菌（Psedomonas sp.）DS1001a降解聚3－羟基丁酸酯（PHB）制备3－羟基丁酸（3－HB）的条件进行了优化.结果表明，该菌株降解PHB制备3－HB的最适培养基条件为：0.2%PHB，0.05%NH4Cl，1.01%Na2HPO4·12H2O，0.39%KH2PO4，0.07%MgSO4·7H2O，0.000 5%CaCl2·2H2O；最适培养条件为：培养温度40℃，装液量150mL，接种量1%，初始pH值6.28，培养时间18h.优化后3－HB的质量浓度为1.555mg／mL，回收率为77.75%，是单因素优化后的1.56倍.

3－羟基丁酸；聚3－羟基丁酸酯；生物降解；条件优化

聚3－羟基烷酸酯（PHAs）是用生物发酵技术合成的脂肪族聚酯，其中最具代表性的是聚3－羟基丁酸酯（PHB），它具有与通用树脂聚丙烯相类似的性质，能纺丝、压膜和注塑成型等［1－2］.然而，PHB最突出的性能是具有完全生物降解性和生物相容性，这是许多化学合成高分子材料所不具备的.因此，PHB作为国际公认的生物降解材料，在工业、农业、医药和环保等领域具有广阔的应用前景［3－4］.

项目组前期的研究发现，某些菌株能够将PHAs降解到单体，特别是PHB降解后可生成3－羟基丁酸（3－HB）［5－7］.3－羟基丁酸具有手征性，可用于色谱分析，以分离光学异构体；还可作为药物中间体，合成手性药物［8］.目前的药物研究中越来越多地集中在生产手性药物上面，因为对病人来说手性药物更安全、更有效，使用剂量更小［9］.3－羟基丁酸除了可以作为合成昂贵化合物的起始原料外，其本身也具有重要的生理作用，已有的研究表明3－羟基丁酸和许多生理疾病的发生及治疗有着非常密切的关系［10－12］，表现出巨大的潜在药用价值.

目前，合成手性羟基脂肪酸（3－羟基丁酸）的主要生产方法有化学合成法及化学降解法.化学方法直接合成3－羟基丁酸需要高温、高压的反应条件以及昂贵的手性金属催化剂等；降解PHB生产3－羟基丁酸，需要耗费大量的有机溶剂、较长的反应时间和高纯度的PHB作为起始物［8］，并极易产生消旋化.另外，Lee等利用基因工程菌，以葡萄糖作为碳源，采用体内生物酶法降解聚羟基脂肪酸酯获得了3－羟基丁酸［13］，但是所需成本较高.

本研究利用一株具有较强PHB降解活性的假单胞菌（Psedomonas sp.）DS1001a，在体外降解聚羟基脂肪酸酯以获得3－羟基丁酸；同时，对该菌株在液体培养基中降解PHB获得3－羟基丁酸的培养条件进行了优化，得到了3－羟基丁酸的高产条件.通过降解条件的选择与优化，使PHB不是直接降解到二氧化碳和水，而是把降解产物控制在3－羟基丁酸，使其成为新的精细化工原料，以为高附加值处理消费后的PHAs一次性制品奠定理论基础，并提供技术支撑.

1 实验材料与方法

1.1菌种

假单胞菌（Psedomonas sp.）DS1001a，一株经过诱变的具有PHB高降解活性的菌株，东北师范大学生命科学学院微生物实验室保存.

1.2聚3－羟基丁酸酯（PHB）

PHB粉末，由天津国韵生物材料有限公司提供.

1.3 3－羟基丁酸（3－HB）

购于Sigma公司，用于标准曲线的测定.

1.4基本培养基

PHB，0.15%；Na2HPO4·12H2O，1.194%；KH2PO4，0.554%；NH4Cl，0.1%；MgSO4·7H2O，0.05%；CaCl2·2H2O，0.000 5%.1×105Pa高温蒸汽灭菌20min［5］.

1.5发酵液中单体含量的测定

将发酵液在4℃条件下12 000r／min离心20min；取上清，用1mol／L浓盐酸调pH＝2.0；超滤离心管（截留相对分子质量3 000）4℃，12 000r／min离心20min，取膜下液进行高效液相分析.

高效液相条件：Shim－pack Vp－ODSC18柱（150mm×4.6mm），流动相为V（乙腈）∶V（水）＝15∶85，紫外检测波长为210nm，进样量20μL，流速1mL／min，柱温10℃.

1.6菌株DS1001a降解PHB制备3－HB单体的单因素条件优化

对菌株降解PHB获得3－HB单体的发酵条件进行优化.设定培养基中PHB含量分别为0.15%，0.20%，0.25%，0.30%，0.35%；NH4Cl含量分别为0.05%，0.10%，0.15%，0.20%，0.25%；Na2HPO4·12H2O／KH2PO4含量比分别为0.73／0.28%，0.87／0.33%，1.02／0.38%，1.16／0.44%，1.31／0.49%；MgSO4含量分别为0，0.01%，0.03%，0.05%，0.07%，0.09%.菌株培养条件：培养温度分别为28℃，30℃，35℃，37℃，45℃；初始pH值分别为5，6，7，8，9；接种量分别为1%，2%，3%，4%，5%，6%；500mL三角瓶中装液量分别为50，100，150，200，250mL.发酵18h后测定发酵液中单体的浓度.

1.7利用响应面方法优化设计

根据单因素条件优化结果，利用响应面分析法的中心组合试验（CCD），以培养温度、初始pH值、装液量3个因素为自变量，分别为X1，X2，X3，以3－HB单体浓度为响应值Y，进行试验设计.

利用软件Design Expert Version 7.0对实验数据进行分析，得到响应值Y与自变量X1，X2，X3的关系，回归方程为

式中：a0是常数项；a1，a2，a3是一次项系数；a12，a13，a23是交互项系数；a11，a22，a33是二次项系数.

对回归方程进行显著性检验和方差分析，并对已回归的方程求一阶偏导，令其等于0，得到3－HB浓度最大时对应的最适条件，在该条件下进行验证实验.

2 结果与讨论

2.1菌株DS1001a降解PHB发酵液中单体含量的测定

将3－HB标准品稀释成不同浓度，使用高效液相检测，在2min左右出现对称峰（见图1），绘制单体含量－峰面积图（见图2），该直线方程为y＝355 741x－16 922，r＝0.999 7.根据标准曲线方程可由高效液相色谱的单体峰面积计算得出样品中3－HB的浓度.

2.2菌株DS1001a降解PHB制备3－HB单体的单因素分析

在基础培养基的基础上进行发酵，每隔6h取一次样，测定发酵液中3－HB的质量浓度，绘制菌株产3－HB的时间曲线（见图3）.由图3可见，培养12～18h3－HB单体含量较高，因此，为方便取样将培养时间定为18h.

2.2.1 培养基成分对制备3－HB单体的影响

对菌株产3－HB的单因素条件进行优化，图4为培养基成分的优化结果，确定的最适培养基组成为：0.2%PHB，0.05%NH4Cl，1.01%Na2HPO4·12H2O，0.39%KH2PO4，0.07%MgSO4·7H2O，0.000 5%CaCl2·2H2O.

图4 （A，C）的结果显示，培养基中的碳源、磷源的含量对产物中3－HB的质量浓度有较明显的影响.由图4（B）可知，氮源在培养基中所需的含量较小，且对产物中3－HB质量浓度影响不大，推断培养基中氮源的匮乏可能对菌株降解PHB生成3－HB的行为有一定的促进作用.另外由图4（D）可知Mg2＋对产物中3－HB质量浓度的影响不成线性规律，在0.07%时浓度较高.培养基中还加入微量的Ca2＋，结果证明Ca2＋对3－HB的质量浓度并无明显影响.

2.2.2 培养条件对制备3－HB单体的影响

图5为菌株培养条件的优化结果，确定的最适培养条件为：培养温度35℃，初始pH＝6，接种量为1%，装液量200mL.其中，图5（A）显示了该菌株在一定温度范围内都表现了较好的PHB降解活性；图5（B）和（D）显示了pH值、装液量对产物中3－HB的质量浓度都有较明显的影响；图5（C）显示了接种量对产物中3－HB质量浓度的影响较不规律，较低和较高的接种量对菌株降解PHB获得3－HB都有较积极的影响.

2.3利用响应面方法优化制备3－HB单体的条件

根据单因素条件优化实验的结果，利用响应面分析法的中心组合试验（CCD），以培养温度、初始pH值、装液量3个因素为自变量，分别设为X1，X2，X3.以产物中3－HB质量浓度为响应值Y，进行3因素5水平的试验设计，每个自变量的5个水平如表1所示，以（－1.68，－1，0，1，1.68）进行编码.中心组合试验方案及结果见表2.

表2中，1—8是析因试验；9—14是星点设计；15—20是中心点重复试验，用来估算误差.采用Design－Expert软件对上表中的响应值及各因素进行回归拟合，得到方程：

其中：Y为响应值，即产物中3－HB的浓度；X1，X2，X3分别代表培养温度、pH值和装液量.由F－test值判定回归方程中各变量对响应值的影响是否显著，概率P越小，则相应变量的显著性越高.方差分析结果见表3.

方差分析的结果表明，该回归方程中各变量对响应值的影响极显著（P＝0.007 7），回归方程的拟合成功.相关系数R2＝82.69%，说明响应值的变化有82.69%来源于所选变量，进而说明该方程能够真实地表达各因素与响应值之间的关系.

回归方程系数的显著性检验结果见表4.由回归方程系数显著性检验可知，其中一次项X2＜0.01极显著，二次项X22＜0.01极显著.表明单因素中pH值对产物3－HB浓度的影响是极显著的.

由响应面回归分析和回归方程拟合可以绘出响应面图和等高线图（见图6—8）.

各因素对实验结果的影响可以通过响应面的三维空间图直观地表现出来，图中的曲面越陡峭，说明该因素对实验结果的影响越大.变量之间的关系可通过等高线图表现出来，等高线呈圆形，说明两因素之间影响不显著；呈椭圆形，说明两因素之间交互作用较大.

另外，从图中可以得到拟合曲面的最大值，从而确定各因素的最佳点，对回归方程求一阶偏导，并令其等于0，可以得到曲面的最大点，即预测的最优条件：温度40℃，pH＝6.28，装液量为150mL，预测产物中3－HB单体的质量浓度为1.225mg／mL.

2.4响应面验证实验

为验证模型的准确性和效能，在响应面法预测的最优发酵条件下进行验证实验，3次重复.结果显示，产物中3－HB的质量浓度可达到1.555mg／mL，与模型预测值1.225mg／mL吻合良好，从而证明了该模型的准确性.如表5所示，通过响应面试验优化后发酵产物中3－HB的浓度是单因素优化后的1.56倍，为优化前的3.81倍.该结果进一步证明了用响应面法寻求最佳发酵条件是可行的.

计算3－HB的收率：用发酵后得到3－HB的量比上培养基中加入的PHB的量，即1.555mg／mL× 100mL÷0.2g等于77.75%.

3 结论

利用响应面分析法能够直观地表现各个变量之间的关系，以及变量和响应值的关系，是一种较好的多条件优化的方法.本文采用单因素条件优化和响应面分析法，对假单胞菌DS1001a降解PHB获得3－HB的条件进行了优化.单因素条件优化的结果确定该菌株降解PHB获得3－HB的最适培养基条件为：0.2%PHB，0.05%NH4Cl，1.01%Na2HPO4·12H2O，0.39%KH2PO4，0.07%MgSO4·7H2O，0.000 5%CaCl2·2H2O；最适培养条件为：培养温度35℃，装液量200mL，接种量1%，初始pH值6.0，培养时间18h.对培养温度、初始pH值和装液量3个变量进行响应面优化后，进一步确定的培养条件为温度40℃，pH值6.28，装液量为150mL.通过优化得到了较高浓度的3－HB，是优化前的3.81倍，其中响应面试验优化是单因素条件优化后的1.56倍，获得的3－HB的回收率达到77.75%.在已报道的生产3－HB的野生菌株中，该菌株可以利用PHB作为唯一碳源降解PHB为3－HB，并具有较高的产量，可以尝试将该菌株应用于PHB材料的回收利用、再生产等.从生物循环的角度着手，将降解PHB的过程与生产3－羟基丁酸的过程结合起来，进一步实现生物资源的再利用，具有较高的商业价值和环保意义.

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Production of 3－hydroxybutyrate by Psedomonas sp.DS1001biodegraded polyhydroxybutyrate

ZHANG Chun－yu1，LI Fan1，SHI Dong－fang2，WANG Yu－meng2，LIU Dong－bo1，XIA Hong－mei1，CHEN Shan1
（1.School of Life Sciences，Northeast Normal University，Changchun 130024，China；2.The Cental Laboratory，Changchun Normal University，Changchun 130032，China）

Used a strain of Psedomonas sp.DS1001ato produce 3－HB by biodegrading PHB，single factor conditions and response surface designs were optimized.The experiments determined the optimal media conditions：0.2%PHB，0.05%NH4Cl，1.01%Na2HPO4·12H2O，0.39%KH2PO4，0.07%MgSO4·7H2O，0.000 5%CaCl2·2H2O.The optimal culture conditions：culture temperature 40℃，liquid volume 150mL，inoculum 1%，initial pH＝6.28，incubation time 18h.The optimized 3－HB concentration was 1.555mg／mL，the recovery was 77.75%，the optimization was 1.56times than before.Determine the yielding conditions by using the strain obtained 3－HB from biodegradation process.

3－hydroxybutyrate；polyhydroxybutyrate；biodegradation；optimization

Q 939.9 ［学科代码］ 180·6150 ［

］ A

（责任编辑：方林）

1000－1832（2015）01－0111－08

10.16163／j.cnki.22－1123／n.2015.01.021

2014－04－22

国家自然科学基金资助项目（31270164）；吉林省科技发展计划项目（20130102062JC）.

张春雨（1988—），女，硕士研究生；通讯作者：陈珊（1955—），女，博士，教授，博士研究生导师，主要从事环境与资源微生物学研究.